Recuperação de microRNA através de Partículas Magnéticas

O conceito de utilizar moléculas de RNA como agentes terapêuticos é relativamente novo, e a sua concretização requer a preparação de RNA em grande quantidade, mantendo a sua integridade, pureza e atividade biológica. Assim, torna-se cada vez mais imperativo o desenvolvimento de novas metodologias de recuperação do RNA cada vez mais eficientes, robustas e seletivas. Independentemente da origem do RNA, as fases de recuperação/isolamento e purificação desta biomolécula são de particular relevância e são cruciais para a obtenção de RNA biologicamente ativo e quimicamente estável. No presente trabalho, a bactéria Rhodovulum sulfidophilum DSM 1374 foi utilizada como hospedeiro recombinante para a produção de RNA, uma vez que apresenta várias vantagens, como a secreção diferencial de ácidos nucleicos durante o crescimento celular e a ausência de RNases. Para a recuperação do RNA presente no meio de cultura de R. sulfidophilum, mantendo a sua estabilidade, foi proposta uma estratégia baseada na utilização de nanopartículas magnéticas (MNP). Esta estratégia apresenta-se como mais vantajosa em relação a outras metodologias aplicadas, uma vez que com a secreção do RNA, o nível de contaminantes é inferior ao encontrado num extrato intracelular, o que facilita o processo de uma forma global. Por outro lado, a recuperação dos RNAs a partir do meio de fermentação poderá ser uma abordagem promissora, já que é evitada a utilização de sais e solventes orgânicos tipicamente necessários em processos convencionais de recuperação de RNA. No geral, é proposto o desenvolvimento de um método económico e rápido para a recuperação de moléculas de RNA funcionais com qualidade e atividade biológica. Neste âmbito, as MNPs foram usadas como meio de captura do RNA pois são fáceis de utilizar e permitem uma operação numa vasta gama de condições. As interações entre o RNA e as MNPs revestidas com o polímero dextrano foram as primeiras a serem investigadas, de maneira a saber em que condições as interações inespecíficas eram minimizadas, de forma a explorar a especificidade da interação do RNA com os ligandos usados na funcionalização das partículas. Verificou-se que com 1,5 M de sulfato de amónio a pHh 7,5 a percentagem de ligação era a mais baixa. Após este estudo inicial, as MNP foram funcionalizadas com diferentes aminoácidos ou derivados (arginina, agmatina, histidina, metionina e tirosina). Os resultados obtidos permitiram concluir que, o método utilizado para a funcionalização das MNP com os aminoácidos, deve ser otimizado, de modo a aumentar a densidade de ligando e, assim, aumentar a ligação do RNA às MNP. Como a estratégia de ligação com 1,5 M de sulfato de amónio em 10 mM de tampão Tris-HCl, a pH 7,5 e a variação da concentração das MNPs de 10 mg/mL para 30 mg/mL, não se traduziu num aumento significativo da ligação do RNA às MNP a estratégia foi alterada, sendo explorada a possibilidade de utilizar as MNPs revestidas para captura de RNA total ao invés de explorar a seletividade. Assim, as MNP revestidas com dextrano foram testadas relativamente à captura de RNA a partir de meios de fermentação de R. sulfidophilum suplementado com RNA, de maneira a avaliar o comportamento das MNP com os componentes do meio. Como a percentagem de ligação foi relativamente baixa e, sabendo que durante o processo de fermentação há consumo de nutrientes e libertação de metabolitos para o meio, a estratégia seguinte consistiu na avaliação do comportamento de ligação em amostras reais de fermentação. A primeira abordagem conduziu a uma captura de 10,6% de RNA, mas após otimização da força iónica do meio, a captura foi significativamente aumentada. Assim, ajustando a força iónica do meio para 1,5 M de sal foi recuperado 12,3% do RNA e um aumento da força iónica para 3 M conduziu a uma recuperação de 30,2%. Estes resultados são muito relevantes uma vez que, a suplementação do meio é um recurso viável tornando possível a captura de uma biomolécula com um crescente interesse por parte da indústria. De uma forma geral, este estudo preliminar permitiu concluir que com altas concentrações molares as percentagens de ligação são mais elevadas e que no futuro deve ser testado um novo método de funcionalização das MNP de maneira a aumentar a ligação e posteriormente, uma possível seletividade das MNPs para RNAs específicos.The concept of using RNA molecules as therapeutic agents is relatively new, and their implementation requires the preparation of RNA in large quantity, maintaining its integrity, purity and biological activity. Thus, it is becoming more and more imperative to develop new, more efficient, robust and selective RNA recovery methodologies. Regardless of the origin of the RNA, the recovery/isolation and purification stages of this biomolecule are of particular relevance, being crucial for obtaining biologically active and chemically stable RNA. In the present work, the bacterium Rhodovulum sulfidophilum DSM 1374 was used as a recombinant host for RNA production, since it has several advantages, such as the differential secretion of nucleic acids during cell growth and the absence of RNases. For the recovery of the RNA present in the culture medium of R. sulfidophilum, maintaining its stability, a strategy based on the use of magnetic nanoparticles (MNP) was proposed. This strategy is more advantageous in relation to other applied methodologies, since with RNA secretion, the level of contaminants is lower than that found in an intracellular extract, which facilitates the process in a global way. On the other hand, the recovery of the RNAs from the fermentation medium may be a promising approach, since the use of organic salts and solvents typically required in conventional RNA recovery processes is avoided. In general, it is proposed the development of an economical and fast method for the recovery of functional RNA molecules with quality and biological activity. In this context, MNPs were used as an RNA capture medium because they are easy to use and allow operation in a wide range of conditions. The interactions between RNA and MNPs coated with the polymer dextran were the first to be investigated, in order to know under what conditions the nonspecific interactions were minimized, allowing to explore the specificity of the RNA interaction with the ligands used in the functionalization of particles. It was found that with 1.5 M of ammonium sulfate at pH 7.5 the binding percentage was the lowest. After this initial study, the MNP were functionalized with different amino acids or derivatives (arginine, agmatine, histidine, methionine and tyrosine). The results obtained allowed us to conclude that the method used to functionalize MNPs with amino acids should be optimized in order to increase the ligand density and thus increase the binding of RNA to MNP. As the binding strategy with 1.5 M ammonium sulfate at pH 7.5 and the concentration variation of the MNPs from 10 mg/mL to 30 mg/mL did not translate into a significant increase in RNA binding with MNP the strategy was altered, being explored the possibility of using the coated MNPs to capture total RNA instead of exploring the selectivity. Thus, dextran-coated MNPs were tested for RNA capture from R. sulfidophilum fermentation media supplemented with RNA in order to evaluate the behavior of MNPs with the media components. As the percentage of binding was relatively low and, knowing that during the fermentation process there is nutrient consumption and release of metabolites into the medium, the following strategy consisted on evaluating the binding behavior in real fermentation samples. The first approach led to a 10.6% capture of RNA, but after optimization of the ionic strength of the medium, capture was significantly increased. Thus, by adjusting the ionic strength of the medium to 1.5 M salt was recovered 12.3% of the RNA and an increase in the ionic strength to 3 M led to a recovery of 30.2%. These results are very relevant since the supplementation of the medium is a viable resource making possible the capture of a biomolecule with a growing interest on the part of the industry. In general, this preliminary study allowed to conclude that with high molar concentrations the percentages of binding are increased and that in the future a new method of functionalization of MNPs must be tested in order to increase the binding and later, a possible selectivity of MNPs for specific RNAs