Minicircular DNA as a potential gene therapy vector in cervical cancer

The Human Papillomavirus (HPV) infects a large number of people worldwide and is associated with more than 99% of cervical cancer, being a second major cause of cancer death in women. HPV E6 oncoprotein is responsible for the progression of this tumor due to the inactivation of the p53 tumor suppressor. Thus, novel therapeutic approaches for the treatment of this cancer have been explored, for example gene therapy, which is based on the insertion of genetic material of interest into the cells, resulting in the expression of proteins encoded by the respective genes. Plasmid DNA has been the non-viral vector mainly used in DNA therapeutics due to its simple manufacture, low toxicity and immunogenicity. Despite some successful cases, the possibility of using a DNA vector of reduced size, decreased toxicity by elimination of the bacterial cassette and able to favor the target gene expression by increased transfection efficiency, makes the minicircular DNA (mcDNA) a very promising gene therapy vector. Therefore, the present work aims to construct a mcDNA vector encoding p53 to reestablish the levels of this tumor suppressor protein in cervical cancer cells and to induce apoptosis. The production of mcDNA started by cloning the p53-encoding sequence into a parental plasmid (PP). Then, Escherichia coli ZYCY10P3S2T strain was transformed by heat shock with the p53-PP vector. The use of this E. coli strain is of major importance since it allows the plasmid recombination to form mcDNA and miniplasmid species by induction with L-arabinose during cell growth. Moreover, after the recombination process, this strain is also able to digest the contaminant miniplasmid through endonucleases action. A highest mcDNAp53/ PP-p53 ratio was achieved by optimizing the recombination step to use 0.01% of Larabinose and 2h of induction. After the production, the mcDNA must be purified for further evaluation of transfection efficiency and cellular effect through in vitro studies. For that, a new chromatographic column was studied in order to explore the simultaneous affinity character of two ligands (arginine and lysine) immobilized in the same functional group (triazine), in which hydrophobic binding/elution conditions were explored and optimized in order to purify the sc mcDNA-p53. When it was used lower salt concentration in the equilibrium step, it seemed that the selectivity of the column was favored, obtaining a sample of sc mcDNA-p53 with lower content of impurities, although the total recovery of the injected sample has been sacrificed. On the other hand, using the strategy of effective binding of the sample to the column and manipulating the pH was seemed to favor the recovery of sc mcDNA-p53 despite containing some impurities. In vitro transfection studies were performed to evaluate the transfection efficiency of PP and mcDNA vectors and the p53 expression, by using HeLA cells. Through immunocytochemistry it was observed that PP and mcDNA vectors were able to transfect HeLa cells, being more efficient with mcDNA. By RT-PCR it was confirmed the presence of p53 transcripts and by western blot it was verified the correct expression of p53 tumor suppressor in transfected cells Overall, this work allowed the construction, biosynthesis and recovery of a minicircular DNA vector encoding the p53 tumor supressor protein, showing great potential to proceed to in vitro and in vivo studies in order to develop a strategy for cervical cancer treatment in the future.O Vírus do Papiloma Humano (HPV) infecta um elevado número de pessoas em todo o mundo, estando associado a mais de 99% do cancro cervical, e por isso, é considerado a segunda maior causa de morte em mulheres. O HPV é característico de inúmeras infeções e doenças associadas ao ser humano, dependendo do tipo de vírus envolvido. O HPV 16 é um vírus de alto risco pertencente ao género alfa-vírus do papiloma da espécie 9 e é o principal promotor da infeção do cancro cervical. O HPV 16 contém uma vasta diversidade genómica, sendo a proteína E6 responsável pela progressão do tumor devido à inativação da proteína supressora de tumor p53. A proteína E6 é considerada uma das proteínas oncogénicas do vírus, pois controla o ciclo celular nas células infetadas e estimula a proliferação celular. Assim, novas abordagens terapêuticas para o tratamento deste cancro têm sido exploradas, nomeadamente, a terapia genética que se baseia na inserção de material genético de interesse nas células, resultando na expressão das proteínas codificadas pelos respetivos genes. O DNA plasmídico (pDNA) é um vetor não viral de baixa toxicidade e imunogenicidade, de fácil obtenção e manipulação, sendo por isso muito explorado em vacinas de DNA e em terapia génica. O plasmídeo contém na sua constituição sequências bacterianas essenciais à sua replicação no hospedeiro recombinante, como o gene de replicação, motivos CpG e marcadores seletivos de antibióticos, assim como a cassete de expressão eucariota constituída por um promotor, o(s) gene(s) de interesse e um terminador. Apesar de já terem sido descritos alguns casos de aplicação terapêutica de pDNA bemsucedidos, atualmente, o uso de DNA minicircular (mcDNA) como vetor multigénico tem sido mais aprofundado uma vez que este apresenta alguns diferenças, que podem ser benéficas em relação ao pDNA. O mcDNA é constituído pela cassete de expressão eucariota, e não inclui as sequências bacterianas e motivos CpG, pois estes podem desencadear respostas imunológicas adversas e apresentar baixa biocompatibilidade e, ainda, não contém os marcadores seletivos de antibióticos que podem causar resistência na flora bacteriana humana. Assim, o mcDNA é um vetor de DNA biologicamente ativo, que além das suas dimensões serem inferiores ao pDNA, não manifesta efeitos citotóxicos inerentes por ser desprovido de sequências bacterianas, apesentando normalmente eficiências de transfeção e expressão de transgenes superiores aos níveis encontrados para o plasmídeo. Portanto, o presente trabalho visa construir um vetor de mcDNA contendo o gene da p53 para restabelecer os níveis desta proteína supressora de tumor em células cancerígenas do colo do útero, de forma a induzir apoptose destas células. A produção de mcDNA começou pela clonagem da sequência codificante da p53 num plasmídeo parental (PP). A estirpe Escherichia coli (E. coli) Top 10 foi transformada por choque térmico com o vetor p53-PP, e após construção, o vetor foi sequenciado para obter a confirmação da inserção da sequência codificante da p53 no vetor. Posteriormente, a estirpe E. coli ZYCY10P3S2T foi transformada por choque térmico com o vetor p53-PP. O uso desta estirpe de E. coli é de grande importância uma vez que esta permite a recombinação do PP, dando origem ao mcDNA e ao miniplasmídeo por indução com L-arabinose durante o crescimento celular. Além disso, no processo de recombinação, esta estirpe também digere o miniplasmídeo contaminante através da ação das endonucleases. De modo a obter um processo de recombinação eficiente, foi necessário otimizar este processo através de estudos no qual foram testados diferentes tempos de indução e diferentes concentrações do indutor L-arabinose. O melhor rácio entre mcDNA-p53/PP-p53 foi conseguido aplicando 0,01% de L-arabinose e 2 horas de indução. Após produção, o mcDNA deve ser extraído e purificado para que possa ser avaliada a eficiência de transfeção e efeito celular deste vetor em estudos in vitro. Têm sido exploradas várias técnicas cromatográficas para a purificação de pDNA mas nem todas permitem obter resultados satisfatórios. Atualmente, a cromatografia de afinidade é a mais estudada para purificação de ácidos nucleicos porque é uma técnica que maximiza a recuperação e pureza do DNA, especialmente o pDNA na sua forma biologicamente ativa, a isoforma superenrolada (sc). Isto deve-se ao facto de a cromatografia de afinidade utilizar o reconhecimento molecular entre as moléculas alvo e os agentes de ligação específica tendo em conta a função biológica e estrutura química dos ligandos, como por exemplo, a utilização de alguns aminoácidos que mostram elevada especificidade e seletividade para reconhecer o pDNA. Por isso, neste trabalho foi estudada uma nova coluna cromatográfica de maneira a explorar o caráter de afinidade simultâneo de dois ligandos de aminoácidos, a arginina e lisina, imobilizados no mesmo grupo funcional, a triazina. Inicialmente foram testadas condições que favorecem maioritariamente interações iónicas ou hidrofóbicas nos passos de ligação/eluição, para se avaliar o perfil de interação entre a amostra e a matriz de modo a purificar o mcDNA-p53 sc. Os melhores resultados foram obtidos por duas estratégias diferentes, tendo-se revelado que uma favorecia a seletividade e a outra favorecia o rendimento de recuperação. Sendo assim, a estratégia de equilíbrio com menor concentração de sal parece favorecer a seletividade da matriz, obtendo uma amostra de sc mcDNA-p53 com menor teor de impurezas, embora a recuperação da amostra injetada não seja total. Por outro lado, o uso da estratégia de ligação efetiva da amostra à matriz, manipulando em simultâneo o pH, parece favorecer a recuperação do mcDNA-p53 na isoforma sc, apesar de conter algumas impurezas. Nos estudos preliminares de transfeção in vitro, foram avaliadas a eficiência de transfeção dos vetores PP e mcDNA e a expressão da proteína supressora de tumor p53. Inicialmente, através de estudos de imunocitoquímica para visualização da expressão da proteína verde fluorescente, verificou-se que a transfeção das células cancerígenas do colo do útero (HeLa) ocorreu com ambos os vetores PP e mcDNA, tendo sido mais eficiente com o mcDNA. De seguida, foi confirmada a presença de transcritos da p53 através de RT-PCR e, por fim, confirmou-se pela técnica de Western Blot a expressão da p53 em células transfetadas. Em suma, este trabalho permitiu a construção, biossíntese e recuperação de um vetor de DNA minicircular que codifica a proteína supressora de tumor p53, mostrando grande potencial para prosseguir com estudos de transfeção in vitro e in vivo no sentido de desenvolver futuramente uma estratégia para o tratamento do cancro do colo do útero