Desenvolvimento de novas metodologias de purificação de DNA minicircular usando suportes monolíticos

Atualmente existem diversas patologias que não têm cura através das terapias convencionais, causando a morte a milhares de pessoas. Assim, torna-se imprescindível o desenvolvimento de terapias alternativas para a sua prevenção e tratamento. A terapia génica e as vacinas de DNA são consideradas terapêuticas promissoras no tratamento de doenças hereditárias e adquiridas. Baseiam-se na transferência de genes e requerem o uso de vetores que sejam seguros e eficientes. Os vetores virais apesar de serem mais eficientes na transferência de genes comprometem a segurança, e como tal tem havido uma crescente aposta na utilização de vetores não-virais como o DNA plasmídico (pDNA). Porém, apesar deste vetor ser mais seguro, de simples produção e de baixo custo, exibe algumas limitações associadas à presença da região de amplificação bacteriana, podendo desencadear respostas inflamatórias e imunitárias ou promover efeitos genotóxicos. Com a finalidade de ultrapassar os obstáculos inerentes ao pDNA, surgiu um novo produto biotecnológico com perspetivas terapêuticas benéficas designado por DNA minicircular (mcDNA). Esta biomolécula resulta de uma recombinação intramolecular do plasmídeo parental (PP) numa cultura bacteriana, sendo constituída exclusivamente pela unidade de transcrição eucariótica. Assim, o mcDNA é considerado um vetor mais seguro, que promove um aumento do efeito terapêutico. Contudo, por ser ainda uma abordagem recente, exige a realização de mais estudos com o objetivo de otimizar-se o processo de recombinação e desenvolver-se um método de purificação adequado, que obedeça às normas impostas pelas autoridades reguladoras, e que consequentemente permita a aplicação terapêutica deste vetor da “nova geração”. O trabalho apresentado nesta tese teve por base o objetivo de obter-se melhores rendimentos de produção de mcDNA, testando diversas percentagens de L-arabinose, e de otimizar a sua recuperação. Posteriormente, foi estudada a etapa de purificação desta biomolécula usando um suporte monolítico de troca aniónica, caracterizado por apresentar uma elevada capacidade de ligação e excelentes propriedades de transferência de massa. Os resultados revelaram que esta coluna apresenta boa resolução e seletividade para separar as impurezas da isoforma superenrolada do mcDNA. Numa primeira fase foi realizada a separação entre o DNA e o RNA, e posteriormente entre o mcDNA e o PP. Averiguou-se que o mcDNA superenrolado tem tendência a eluir primeiramente, o que poder-se-á justificar pelo seu tamanho mais reduzido, apresentando uma densidade de carga inferior. A fim de confirmar-se a pureza da amostra obtida efetuaram-se ensaios de quantificação de diversos contaminantes que revelaram a ausência de RNA e de proteínas, e que a quantidade de DNA genómico e de endotoxinas obedecia aos valores referenciados pelas agências reguladoras, como a “Food and Drug Administration” (FDA). Em suma, a utilização deste suporte monolítico pode ser uma solução promissora para a obtenção da amostra de mcDNA com a qualidade adequada para futuras aplicações terapêuticas.Nowadays there are several diseases that fail to cure with conventional therapies, killing thousands of people. Therefore, it is essential to develop alternative therapies for prevention and treatment of these diseases. Gene therapy and DNA vaccines are considered promising therapeutics in the treatment of inherited and acquired diseases. They are based on gene transfer and require the use of safe and effective vectors. Viral vectors allow the efficient gene transfer, but compromise the security. For this reason, it was wagered increasingly the use of non-viral vectors such as plasmid DNA (pDNA). This vector is safe, simple and with low cost production, but has some limitations associated with the presence of bacterial amplification region, potentially triggering inflammatory and immune responses or promoting genotoxic effects. To overcome the pDNA limitations, it appeared a new biotechnology product with beneficial therapeutic perspectives named DNA minicircular (mcDNA). This biomolecule results from the intramolecular recombination of the parent plasmid (PP) in a bacterial culture, being constituted only by eukaryotic transcription unit. Thus, the mcDNA is considered a safer vector, which promotes an increase in the therapeutic effect. However, given that it is a new approach requires further studies with the aim of optimizing the recombination process and to develop a method of suitable purification, complying with the standards imposed by regulatory agencies, and consequently allow the therapeutic application of this vector of "new generation". The aim of the work presented in this thesis was to get better mcDNA production yields, testing various percentages of L-arabinose, and optimize their recovery. Subsequently, was studied the biomolecule purification step using an anion exchange monolithic support, characterized for the high binding capacity and excellent mass transfer properties. The results revealed that this column shows good resolution and selectivity to firstly eliminate the RNA impurity and then to separate the supercoiled mcDNA isoform from other ineffective topologies, such as open circular mcDNA or PP isoforms. It was established that the mcDNA tends to elute first, which can be justified by its smaller size, with a lower charge density. In order to confirm the purity of the obtained sample, quantification assays of various contaminants were performed, which revealed the absence of RNA and proteins, and the amount of genomic DNA and endotoxins obeyed the values referenced by the regulatory agencies such as "Food and Drug Administration" (FDA). In conclusion, the use of a monolithic support may be a promising approach for obtaining the mcDNA sample of adequate quality for future therapeutic applications