Pesquisa e identificação de compostos bioativos em plantas florestais

A avaliação científica e experimental das propriedades das plantas, que os ancestrais utilizavam na medicina tradicional, conhece um grande desenvolvimento, nomeadamente na procura de novos compostos com propriedades antioxidantes e anti-microbianas. Os compostos com propriedades antioxidantes podem ser utilizados na medicina no tratamento de patologias, relacionadas com o stresse oxidativo, em alternativa à terapêutica habitual, ou pela indústria alimentar, na confeção de alimentos funcionais, ou como substitutos dos antioxidantes sintéticos. Os compostos anti-microbianos podem ser utilizados no tratamento de infeções por microrganismos resistentes aos antibióticos convencionais e na indústria alimentar na conservação dos alimentos. A área florestal portuguesa ascende aos 3,3 milhões de hectares, o que representa cerca de 38% do território, sendo uma importante fonte de matéria-prima com potencial atividade biológica. De entre o conjunto de constituintes ativos das plantas, os fenóis e os flavonoides têm sido estudados quanto às suas propriedades antioxidantes e de sequestração de radicais livres, assim como na inibição da peroxidação lipídica. As propriedades anti-microbianas destes compostos têm sido referidas, pois estes exercem nas plantas ação protetora contra microrganismos patogénicos. O objetivo geral deste trabalho foi melhorar o conhecimento sobre as atividades biológicas de extratos obtidos a partir de espécies vegetais existentes no ecossistema da Serra da Estrela (Echinospartum ibericum, Pterospartum tridentatum, Juniperus communis, Ruscus aculeatus, Rubus ulmifolius, Hakea sericea, Cytisus multiflorus, Crataegus monogyna, Erica arborea, Ipomoea acuminata e Ailanthus altissima), e de definir procedimentos para a sua extração e valorização como produtos naturais para uso terapêutico e/ou nutracêutico. Assim, com este trabalho pretendeu estudar-se as propriedades antioxidantes, anti-microbianas e citotóxicas de extratos das diversas partes aéreas (caules, folhas, flores e frutos) dos arbustos mencionados, e analisar o respetivo perfil fitoquímico, no que respeita a algumas classes de metabolitos secundários (fenóis, flavonoides, taninos e alcaloides). O método do reagente de Folin-Ciocalteu foi utilizado para a determinação do teor de fenóis totais e os taninos foram precipitados, a partir destes, com polivinilpolipirrolidona (PVPP); um método colorimétrico com cloreto de alumínio foi usado para a determinação dos flavonoides, e o método do reagente de Dragendorff foi utilizado para a estimativa dos alcaloides totais. O teste do 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) e o sistema β-caroteno/ácido linoleico foram utilizados para avaliar a atividade antioxidante dos extratos. A identificação dos compostos fenólicos presentes nos extratos foi efetuada por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC). A atividade anti-microbiana dos extratos metanólicos de Hakea sericea foi avaliada pelo método da difusão em disco e pela determinação da Concentração Mínima Inibitória (MIC). A atividade anti-biofilme foi avaliada através da quantificação da biomassa total do biofilme utilizando o violeta de cristal, e pela avaliação da atividade metabólica do biofilme pelo método do 3′-{1-[(phenylamino)-carbonyl]-3,4-tetrazolium}-bis (4-methoxy-6-nitro)benzene-sulfonic acid hydrate (XTT) . A citotoxicidade foi avaliada por ensaios de hemólise e pelo teste do 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). A maioria dos extratos dos arbustos estudados apresentou um teor elevado de compostos fenólicos, bem como, propriedades antioxidantes significativas, que são provavelmente devidas à existência dos compostos fenólicos nos extratos, dado que se observou uma correlação linear positiva entre o Índice de Atividade Antioxidante (AAI) e teor de fenóis totais dos extratos. O procedimento de RP-HPLC mostrou que os compostos mais comuns eram os ácidos ferúlico e elágico e a quercetina. Destaca-se que para as espécies Echinospartum ibericum, Hakea sericea e Ipomoea acuminata, não existem estudos fitoquímicos anteriores e não se conhecem utilizações destas plantas na medicina tradicional. No geral, os extratos das folhas têm maior concentração de compostos fenólicos do que as outras partes aéreas dos arbustos. Resultados preliminares demonstraram as potenciais propriedades anti-microbianas da espécie Hakea sericea, que é um arbusto invasivo nas florestas Portuguesas. Neste trabalho foi avaliada a atividade anti-microbiana de extratos de Hakea sericea em várias espécies de microrganismos, incluindo a capacidade de inibição da formação de biofilmes. Adicionalmente foram avaliadas as propriedades citotóxicas destes extratos em células humanas. Para as bactérias Gram-positivas, os valores de MIC dos extratos metanólicos de Hakea sericea variaram entre 0.040 e 0.625mg/mL, enquanto para o extrato dos frutos se obtiveram os menores valores de MIC para várias espécies de microrganismos, nomeadamente, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes e estirpes clínicas de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA). Os extratos dos caules e dos frutos (2.5mg/mL) erradicaram completamente os biofilmes das estirpes Staphylococcus aureus ATCC 25923, SA 01/10 e MRSA 12/08. Relativamente à toxicidade destes extratos, para as folhas, não foi observada hemólise, e no caso dos caules e dos frutos, apenas se verificou hemólise para concentrações muito elevadas, o que sugere a baixa toxicidade destes extratos. O extrato dos frutos não apresentou nenhum efeito tóxico para as células NHDF (Normal Human Dermal Fibroblasts), no entanto, para as concentrações de 0,017 e 0.008mg/mL, este extrato diminuiu a viabilidade da linha de células cancerígenas MCF-7 (human breast adenocarcinoma cells) em 60%, como os resultados do teste do MTT comprovaram. Após se ter verificado que o extrato metanólico bruto dos frutos de Hakea sericea apresentava significativa atividade biológica, procedeu-se ao seu fracionamento bioguiado, o que levou ao isolamento e identificação de um novo alquenilresorcinol, o ácido 9-(3,5-dihidroxi-4-metilfenil)nona-3-(Z)-enóico, composto aqui pela primeira vez descrito. A estrutura deste novo composto foi comprovada por espetroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), de infravermelho (FTIR) e por espetroscopia de massa de alta resolução (HRMS). As propriedades antibacterianas do novo alquenilresorcinol foram estudadas pela determinação dos seus valores de MIC contra várias bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, utilizando o método da resazurina. O alquenilresorcinol isolado e identificado inibiu o crescimento das bactérias, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes e Bacillus cereus, com valores de MIC de 0.31, 0.02 e 0.16mg/mL, respetivamente. Baixos valores de MIC foram também obtidos contra as estirpes de Staphylococcus aureus (0.005-0.16mg/mL), incluindo os isolados clínicos (SA 01/10 e SA 02/10) e as estirpes de MRSA. Dado que foram identificados nos extratos das plantas estudadas, vários compostos fenólicos, nomeadamente os ácidos gálico, cafeico e clorogénico, e como este grupo de compostos possui diversas atividades biológicas, foram neste trabalho analisadas as suas potenciais propriedades anti-microbianas e anti-biofilme em estirpes de Staphylococcus aureus, bem como o seu mecanismo de ação. Concluiu-se que estes ácidos fenólicos têm propriedades antiestafilocócicas, por exemplo, o ácido gálico influenciou as propriedades de adesão das células de Staphylococcus aureus. A produção de α-hemolisinas por estes microrganismos também foi inibida pelos ácidos gálico e cafeico. Em relação ao seu mecanismo de ação, o ácido cafeico interfere na estabilidade da membrana e com a atividade metabólica das células de Staphylococcus aureus. Em suma, este trabalho, contribuiu para o melhor conhecimento das propriedades biológicas de diversas espécies vegetais, valorizando algumas para as quais não é conhecida nenhuma aplicação na medicina tradicional, nomeadamente Echinospartum ibericum, Ailanthus altissima, Hakea sericea. Por outro lado, permitiu isolar de uma espécie invasora, um novo alquenilresorcinol com propriedades anti-microbianas, permitindo deste modo contribuir para a valorização da biomassa florestal e para a descoberta de um potencial novo antibiótico.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT