Determinação de antidepressivos em plasma humano por cromatografia líquida de rápida resolução acoplada a um detector de fotodiodos (UPLC-DAD)

O consumo de medicamentos usados para o tratamento das depressões tem vindo a aumentar ao longo da última década. Segundo a Intercontinental Medical Statistics Health (IMS Health), os antidepressivos, a terceira classe terapêutica mais utilizada a nível mundial, tiveram em 2000 um aumento de 18%, representando 4,2% do mercado farmacêutico global. Em Portugal, os dados publicados pelo Instituto Nacional da Farmácia e do Medicamento (Infarmed) referem que o subgrupo farmacoterapêutico antidepressivos e psicotrópicos estava, em 2000, entre os 10 primeiros no que diz respeito aos encargos para o Serviço Nacional de Saúde (SNS) atingindo os 98 milhões de euros por ano. Por outro lado, o consumo destes medicamentos por parte da população não está totalmente controlado, já que para além dos problemas de automedicação é possível a sua aquisição através da Internet. Tal tem contribuído para o aumento dos casos de etiologia médico-legal suicida e para que os antidepressivos sejam considerados o segundo grupo de substâncias mais pesquisado na rotina laboratorial de toxicologia. Assim sendo, advém a necessidade de elucidação de uma metodologia validada de forma a garantir que a mesma seja capaz de gerar informações confiáveis e interpretáveis. Posto isto, o objectivo deste trabalho prende-se com a validação de uma metodologia analítica baseada na cromatografia líquida acoplada a um detector de diode array (UPLC/DAD) associada à extracção em fase sólida para a determinação de 9 antidepressivos (venlafaxina, trazodona, maprotilina, nortriptilina, fluoxetina, dotiepina, sertralina, amitriptilina e clomipramina) em plasma humano. Utlizando um volume de amostra de 500 μL, o método foi validado de acordo com as normas internacionalmente aceites para a validação de métodos bioanalíticos. Os parâmetros estudados foram a selectividade, especificidade, curva de calibração e linearidade, limite inferior de quantificação (LLOQ), limite de detecção (LOD), precisão, exactidão e recuperação. O método demonstrou elevada sensibilidade, uma vez que, com a injecção no sistema cromatográfico de apenas 2 μL de amostra com antidepressivos, conseguiu visualizar-se resposta, traduzida pelos picos que surgiram no cromatograma. O método foi selectivo, já que não foram detectados interferentes após análise de amostras brancas de plasma, tendo sido obtida uma resposta linear entre 0,1 – 5 μg/mL para todos os antidepressivos, à exepção da sertralina, cujo intervalo de linearidade foi de 0,25 – 5 μg/mL. Os valores obtidos para a precisão e exactidão intra- e interdia estavam em conformidade com os critérios de validação mencionados, ou seja, coeficientes de variação inferiores a 15% e BIAS dentro de um intervalo de ± 15% da concentração teórica (excepto no LLOQ, para o qual foi considerado adequado o intervalo de ± 20%). Quanto à recuperação obtida, os valores oscilaram entre 72 – 95%. Por último para avaliar a aplicabilidade da metodologia, esta foi aplicada a 3 casos de intoxicação hospitalar. Em conclusão, o método provou ser adequado para a determinação dos antidepressivos estudados em situações de intoxicação clínica ou forense.The consumption of drugs used to treat depression has been increasing over the last decade. According to Intercontinental Medical Statistics Health (IMS Health), antidepressants, the third most used therapeutic class worldwide, had in 2000 an increase of 18%, representing 4.2% of global pharmaceutical market. In Portugal, data published by the National Institute of Pharmacy and Medicine reported that the pharmacotherapeutic subgroup of antidepressants and psychotropics, was in 2000, in the top 10 with regard to costs for the National Health Service (NHS), reaching the 98 million Euro per year. On the other hand, the consumption of these drugs by the population is not fully controlled, and problems with self-medication exist; indeed, it is possible to purchase those drugs on the Internet. This has contributed to the increase in suicide cases, being antidepressants the second most encountered group of substances in routine toxicology laboratories. Therefore, there is the need for the development of a validated methodology to ensure that it is able to generate reliable and interpretable information. The aim of this work was the validation of an analytical methodology based on liquid chromatography coupled to a diode array detector (UPLC/DAD) associated with solid phase extraction for the determination of nine antidepressants (venlafaxine, trazodone, maprotiline, nortriptyline, fluoxetine, dotihepin, sertraline, clomipramine and amitriptyline) in human plasma. Using a sample volume of 500 µL, the method was validated according to internationally accepted standards for the validation of bioanalytical methods. The parameters studied were selectivity, specificity, calibration curve and linearity, lower limit of quantification (LLOQ), limit of detection (LOD), precision, accuracy and recovery. The method demonstrated high sensitivity, since only 2 µL was injected in the chromatographic system. The method was selective as no interferences were detected after analysis of blank samples of plasma, and a linear response was obtained between 0.1 and 5 µg/mL for all antidepressants, except for sertraline (0.25 and 5 µg/mL). The values obtained for intra- and interday precision and accuracy were in agreement with the mentioned criteria, that is, coefficients of variation less than 15% and BIAS within a range of ± 15% of theoretical concentration (except for LLOQ, for which ± 20% was accepted). The recovery values ranged from 72 to 95%. Finally to evaluate the applicability of the methodology, it was applied to three intoxication hospital cases. In conclusion, the method proved to be suitable for the determination of those antidepressants in clinical or forensic intoxication scenarios