Pesquisa de vírus entéricos humanos em amostras de lodo da estação de tratamento de esgoto (sistema insular) de Florianópolis, SC: padronização e avaliação de técnicas moleculares e de cultura celular na deteccção e viabilidade viral

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.A alta incidência de patógenos virais no lodo de esgoto é devido a sua adsorção preferencial aos sólidos do lodo. Dependendo do método de tratamento utilizado para a esterilização do esgoto doméstico, entre 50% e 99,9% dos vírus podem ser inativados. O lodo tratado pode ser útil para fins agrícolas porque pode melhorar as propriedades físicas do solo e aumentar o teor de matéria orgânica. Entretanto, as desvantagens de sua utilização são a possível transferência de microorganismos patogênicos para o solo. O potencial de partículas virais infecciosas remanescentes após o tratamento do lodo não pode ser descartado. Assim, métodos confiáveis são necessários para determinar o nível de contaminação viral em resíduos de lodo espalhados no solo para finalidades agrícolas. O objetivo deste estudo foi padronizar e avaliar uma metodologia simplificada para a detecção de vírus entéricos humanos em lodo de esgoto. Para a etapa de padronização, o lodo coletado foi esterilizado em autoclave e semeado com diluições seriadas de base 10 de Adenovírus (AdV5) ou Rotavírus (RV). As amostras foram posteriormente processadas por um método de adsorção-eluição-precipitação utilizando floculação orgânica e precipitação com polietileno glicol. Durante a etapa de eluição-precipitação, AdV5 foi utilizado como modelo e diferentes parâmetros foram avaliados, incluindo a quantidade de eluente viral e o período de incubação utilizado para a concentração viral. Dois diferentes métodos para a extração dos ácidos nucléicos foram utilizados: isotiocianato de guanidina-sílica e fenol-clorofórmio. O método padronizado (utilizando fenol-clorofórmio como método de extração dos ácidos nucléicos) foi o mais sensível e foi capaz de detectar até 6,3x10-1 (amostra semeada antes da eluição viral) e 1,26x10-1 (amostra semeada após o processo de clarificação) PFU de AdV5 e 2,4x10-1 (amostra semeada antes da eluição) e 2,16x101 (amostra semeada após a clarificação) FFU de RV. Este método foi posteriormente aplicado à detecção de AdV, vírus da Hepatite A (HAV), poliovírus (PV) e RV em amostras de lodo de esgoto coletadas durante 12 meses numa Estação de tratamento de esgoto de Florianópolis (ETE/CASAN/Florianópolis, Brasil). PCR, nested PCR, RT PCR, RT nested PCR e quantificação por PCR/RT-PCR em tempo real foram usados para a detecção e quantificação do genoma viral. PCR integrado a cultura celular (ICC-PCR) e a Imunofluorescência indireta (IFI) foram utilizados para os ensaios de viabilidade e quantificação viral. Das 12 amostras de campo analisadas tanto para a presença do genoma viral (PCR/nested PCR ou RT-PCR/RT nested PCR) e viabilidade viral, foram obtidos os seguintes resultados: AdV: 100% das amostras positivas para genoma e viáveis (todas cepas não entéricas como determinado pela análise PCR-RFLP); HAV: 25% positivas para genoma e 16,7% viáveis; PV: 66,7% positivas para genoma e 91,7% viáveis; RV: 33,3% positivas para genoma e 25% viáveis. A quantificação por PCR/RT-PCR em tempo real foi utilizada para quantificar cópias de genoma de AdV e HAV em amostras de campo positivas. AdV e HAV variaram de 4,6x104 a 1,2x106 e de 3,1x102 a 5,4x102 cópias de genoma/ml, respectivamente, em amostras de lodo de esgoto. IFI foi utilizada para quantificar as partículas de AdV nas amostras de campo e os resultados variaram de 70 a 300 FFU/ml. Os resultados obtidos no presente trabalho mostram que a contaminação viral é um problema mesmo em amostras de esgoto tratadas e que o tratamento usual aplicado para o tratamento do lodo de esgoto não é capaz de eliminar a contaminação viral