Engenharia genômica de leveduras Saccharomyces cerevisiae utilizadas na produção industrial de álcool combustível

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2012.As leveduras Saccharomyces são amplamente utilizadas na produção de álcool combustível graças à sua capacidade de adaptação ao ambiente industrial, e à habilidade de fermentar açúcares eficientemente. A sacarose, açúcar majoritário nos mostos utilizados no Brasil, é um dissacarídeo hidrolisado pela enzima invertase, que é codificada pelos genes SUC e secretada pelas leveduras. Dessa forma, obtêm-se, no meio, glicose e frutose, monossacarídeos que são transportados para o interior da célula e fermentados até etanol e CO2. No entanto, recentemente foi descrita uma outra via para a eficiente fermentação de sacarose envolvendo o transporte ativo do açúcar para o interior da célula, mediado pela permease AGT1, e sua hidrolise pela invertase intracelular. No presente trabalho uma linhagem industrial da levedura S. cerevisiae, que tende a dominar as dornas de fermentação, foi modificada utilizando técnicas de engenharia genômica visando a fermentação da sacarose através da sua captação direta. A estratégia envolveu sobre-expressar a invertase intracelular (iSUC2) e utilizar o gene da permease AGT1 (flanqueado por sequências que permitem sua sobre-expressão) para deletar a outra cópia do gene SUC2 presente no genoma diploide da levedura, impedindo portanto sua hidrólise extracelular. Embora as modificações genéticas tenham sido realizadas com sucesso, os resultados indicam que na linhagem industrial modificada (iSUC2 + suc2::AGT1) existem outros genes SUC que expressam a invertase extracelular.Abstract : Saccharomyces yeasts are widely used in the production of fuel ethanol due to its capacity to adapt to the industrial environment, and the ability to ferment sugars efficiently. Sucrose, the major sugar in musts used in Brazil, is a disaccharide hydrolyzed by the enzyme invertase secreted by yeasts and encoded by the SUC genes. Thus, glucose and fructose are obtained and transported into the cell in order to be fermented into ethanol and CO2. However, another pathway for efficient sucrose fermentation was recently described involving the active transport of the sugar into the cell mediated by the AGT1 permease, and its hydrolysis by the intracellular invertase. In this work an industrial S. cerevisiae yeast strain, which tends to dominate the fermentation vats, was modified using genomic engineering techniques aiming the fermentation of sucrose by its direct uptake. The strategy involved over-expression of the intracellular invertase (iSUC2) and the use of the AGT1 permease gene (flanked by sequences that allow its over-expression) to delete the other copy of the SUC2 gene present in the diploid genome of yeasts, preventing its extracellular hydrolysis. Although the genetic modifications were performed successfully, the results indicate that in the modified industrial strain (iSUC2 + suc2::AGT1) there are other SUC genes that express the extracellular invertase