Mécanismes sous-tendant la formation des NETs et les réponses des neutrophiles aux cristaux d’urate

Neutrophils are an essential component of the innate immune system. They are the first and most abundant leukocytes to migrate to the site of inflammation. Upon arrival, neutrophils perform various functional responses: phagocytosis, respiratory burst, production of lipid mediators and cytokines, neutrophil extracellular trap (NET) formation, etc. Despite the importance of NETs, signaling pathways that control NET formation are only partialy understood. Likewise, current quantification methods that are used to study mechanisms of NET formation suffer from significant drawbacks. As part of this thesis, we used new fluorescent polymers that only bind extruded chromatin, allowing a specific and standardized quantification of NETosis that could not be easily performed before. This approach allowed us to rank the relative potency of various physiologic NET inducers reliably, and to show that inhibition of the Syk or PI3K pathways blocks NETosis by acting upon late events in NET formation. By comparison, inhibition of the TAK1, p38 MAPK, or MEK pathways also disrupted NETosis, but by acting on early events. In contrast, inhibiting PKC, Src family kinases, or JNK failed to prevent NET formation; inhibitors of translation and transcription (cycloheximide and actinomycin D respectively) were likewise ineffective. The role of the NADPH oxidase in NET formation was also revisited. We confirmed that pharmacological PKC activator (PMA) induced NET formation that depends on the oxidase, contrarily NETosis occurring in response to physiological agonists is ROS-independent. Finally, we demonstrated for the first time that selective inhibition of protein arginine deiminase 4 (PAD4) potently prevents NETosis in human neutrophils by all stimuli tested. The second part of my thesis is devoted to revisiting how monosodium urate (MSU) crystals interact with neutrophils. Deposition of insoluble MSU in joints is known to trigger gout, a prevalent chronic inflammatory disease that is commonly associated with massive neutrophil infiltration. Several studies have focused on the mechanisms underlying the numerous actions of MSU crystals towards neutrophils. However, our knowledge of the signaling pathways involved remains fragmentary. During the work on this thesis, genomic and proteomic changes triggered by MSU in neutrophils were examined. Additionally, the role of various signaling pathways in MSU-induced neutrophil functional responses was studied. This allowed us to show for the first time that neutrophils can secrete CCL4 in response to MSU. Accordingly, it was demonstrated that MSU crystals belatedly activate transcription factors NF-κB, CREB, and C/EBP, and at least the former is involved in cytokine generation. Additionally, we showed that MSU activates MAPKs in neutrophils, that they are under the control of TAK1 and/or Syk, and that they participate in cytokine generation and NET formation. Data obtained during the work on this thesis substantially extends current knowledge of neutrophil signaling pathways controlling the cytokine generation and NET formation. Taking in to account the involvement of neutrophil functional responses in various pathologies (and especially gouty arthritis), our findings identify potential molecular targets that could be exploited for therapeutic intervention.Les neutrophiles représentent un élément essentiel du système immunitaire inné. Ils sont les premiers leucocytes à migrer au site d’inflammation. Une fois au site inflammatoire, les neutrophiles effectuent une multitude de réponses fonctionnelles : la phagocytose, la dégranulation, la flambée oxydative ainsi que laproduction de médiateurs lipidiques et de cytokines. En plus de ces réponses, les neutrophiles produisent aussi des trappes extracellulaires (NETs). La production de NETs a initialement été décrite comme une réponse antimicrobienne, mais des évidences récentes ont montré son implication dans le développement de plusieurs maladies (goutte, arthrite inflammatoire, psoriasis, etc.) et dans certains cancers. Malgré l’importance des NETs, les voies de signalisation contrôlant leur formation en réponse à des stimuli physiologiques ne sont que partiellement élucidées. De plus, les méthodes de quantification couramment utilisées pour étudier la formation des NETS comportent plusieurs désavantages. C’est pourquoi les travaux présentés dans cette thèse utilisent de nouveaux polymères fluorescents se liant uniquement à la chromatine extrudée, qui permettent une quantification spécifique et standardisée des NETs. Cette méthode a permis d’établir l’efficacité relative de plusieurs stimuli physiologiques induisant les NETs. Il a également été démontré, chez les neutrophiles activés avec du GM-CSF, du fMLP, ou du TNF, que l’inhibition des voies de signalisation de Syk et de PI3K bloque la NETose en interférant avec les étapes tardives de la formation des NETs. Par ailleurs, l’inhibition des voies de TAK1, de la MAPK p38, ou de MEK empêche aussi la formation des NETs, mais en affectant cette fois des étapes précoces de la NETose. En revanche, l’inhibition de PKC, des kinases de la famille Src ou de JNK n’a pas d’effet sur la formation de NETs; idem pour l’inhibition de la synthèse protéique ou de la transcription. Quant aux mécanismes impliqués dans la formation de NETs, nous avons vérifié le rôle de la NADPH oxidase dans la NETose induite par des stimuli physiologiques. En utilisant notre nouvelle technique de quantification, nous avons confirmé que la formation de NETs induite par le PMA est abolie par l’inhibition de la NADPH oxydase. Par contre, la formation de NETs en réponse à des agonistes physiologiques (fMLP, GM-CSF, TNF) est indépendante de la production de réactifs oxygénés (ROS). De plus nous démontrons pour la première fois que l’inhibition sélective de PAD4 diminue drastiquement la NETose chez les neutrophiles humains et ce, pour tous les stimuli testés. Une autre section de la thèse porte sur l’interaction entre les cristaux d’urate monosodique (MSU) et les neutrophiles. Le dépôt de MSU dans les articulations déclenche la goutte, une maladie inflammatoire chronique répandue qui est communément associée à une importante infiltration des articulations enflammées par les neutrophiles. Le MSU induit chez les neutrophiles la production de cytokines et de chimiokines, la formation de ROS, ainsi que la relâche de peptides antimicrobiens et d’enzymes protéolytiques. Les neutrophiles activés par le MSU produisent également des NETs. Bien que plusieurs études aient porté sur les mécanismes contrôlant les effets des cristaux de MSU sur les neutrophiles, notrecompréhension des voies de signalisation impliquées demeure fragmentaire. Dans la cadre de la thèse, les changements génomiques et protéomiques causés par le MSU chez les neutrophiles ont été étudiés. De plus, les rôles de multiples voies de signalisation induites par le MSU chez les neutrophiles ont été examinés. Nous montrons pour la première fois que les neutrophiles peuvent sécréter la chimiokine CCL4 en réponse au MSU. Nous démontrons de surcroît que les cristaux de MSU activent tardivement les facteurs de transcription NF-κB, CREB, et C/EBP et que au moins NF-κB est impliqué dans la production de cytokines. Enfin, nous avons établi que le MSU active les MAPK chez les neutrophiles, que leur activation est tributaire de TAK1 et/ou de Syk, et que ces voies de signalisation participent à la production de cytokines et à la NETose. Les résultats présentés dans cette thèse avancent substantiellement les connaissances actuelles sur les voies de signalisation et les mécanismes moléculaires contrôlant la synthèse et la relâche des cytokines ainsi que la formation de NETs en réponse à des stimuli physiologiques (MSU, GM-CSF, fMLP, TNF) chez le neutrophile humain. Etant donné le rôle crucial joué par les neutrophiles et leurs réponses fonctionnelles dans plusieurs pathologies, ces découvertes pourraient mener à l’identification de cibles moléculaires nouvelles dans une perspective thérapeutique