Purification et caractérisation de l'aldolase de Thermus Aquaticus

La fructose-1,6-diphosphate aldolase est une enzyme essentielle de la glycolyse, qui catalyse la conversion réversible du fructose-1,6-diphosphate (Fru-1,G-P2) en glycéraldéhyde-3-phosphate (G-3-P) et en dihydroxyacétone-phosphate (DHAP). Il existe deux classes d'aldolase, ayant apparemment évolué séparément. Plus particulièrement, l'aldolase de classe II est une métallo-enzyme avec des propriétés physico-chimiques tout à fait différentes de celles de la classe I. Ce travail présente la purification jusqu'à homogénéité, ainsi que la caractérisation de l'aldolase de classe II, de l'organisme thermophile Thermus aquaticus. Sa masse moléculaire a été déterminée être entre 160-180 kDa et son point isoélectrique est de 5.8. Le début de la séquence N-terminale de l'aldolase a été déterminée et comparé à d'autres séquences N-terminales d'aldolases de classe II. L'homologie entre les séquences N-terminales des organismes thermophiles est plus élevée; elle indique des acides aminés probablement importants pour la thermostabilité. La caractérisation plus approfondie de cette enzyme, montre qu'elle est complètement thermostable pendant au moins 2 heures à 80 °C et que sa demi-vie est plus élevée que 2 heures à 93 °C. L'observation d'une forte adsorbtion de l'aldolase de Taq sur matrice hydrophobe, comparé à l'adsorbtion moins importante de l'aldolase homologue de E.coli, suggère que la thermostabilité de l'aldolase de Taq, proviendrait en partie de son caractère plus hydrophobe en périphérie. On constate aussi que l'aldolase de Taq peut être activée par plusieurs facteurs. Notamment, l'enzyme est activée par l'ajout de certains détergents, alcools et, de façon plus spectaculaire, par l'ajout de l'ion métallique cobalt. L'activation par un ion métallique exogène est une particularité de l'aldolase de Taq. Elle peut être vue comme un moyen de compenser la plus faible activité spécifique de l'aldolase de Taq, comparée à l'activité des autres aldolases de classe II. L'ajout de cobalt exogène n'augmente toutefois pas la thermostabilité de l'aldolase. La création d'apoaldolase, à l'aide du chélateur EDTA, a été tentée afin d'observer l'importance de l'ion métallique intrinsèque pour la thermostabilité. Cependant, le traitement au EDTA, suivi d'une dialyse, ne procure pas la certitude que l'inhibition d'activité engendrée provient du retrait de l'ion métallique du site actif. On peut dire toutefois, que ce processus n'a pas d'effet important sur la thermostabilité de l'aldolase à 90 °C. Enfin, il est démontré que la cinétique de l'aldolase avec le substrat Fru-1,5-P2 à 80 °C, exhibe une coopérativité négative. On observe aussi que les produits engendrés par l'action de l'aldolase sur ce substrat, sont instables à haute température alors que le substrat est thermostable. De plus, la prochaine enzyme de la glycolyse, la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GPDH), est en quantité inférieure à l'aldolase et sa vitesse maximale est équivalente à celle de l'aldolase. Afin d'expliquer la coopérativité négative, on peut amener l'hypothèse suivante : Sans la diminution d'affinité de l'aldolase pour son substrat lors d'une augmentation de concentration, la vitesse serait plus élevée et les produits instables engendrés ne pourraient plus être utilisés assez rapidement par la GPDH afin d'empêcher leur dégradation ou leur réaction avec d'autres éléments. Ainsi, lorsqu'il y aurait augmentation de la concentration de substrat, la coopérativité négative permettrait de réduire le flux de la voie métabolique et de maintenir les ressources énergétiques sous une forme plus thermostable