Efeito da S-nitrosilação sobre a estrutura de PtpA, e clonagem e caracterização inicial de PtkA e SapM de Mycobacterium tuberculosis

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biolólogicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2012A S-nitrosilação de PtpA de Mycobacterium tuberculosis diminui sua atividade fosfatase. O objetivo deste trabalho é investigar o efeito da S-nitrosilação nos parâmetros cinéticos e na estabilidade térmica de PtpA. Por meio de ensaios de biotin switch observou-se que a substituição do resíduo Cys53 por um resíduo de alanina em mutantes resultou em proteínas incapazes de se ligar a biotina após tratamento com doador de NO. Observou-se também que a KM da PtpA nitrosilada foi semelhante à sua forma não modificada, mas a Vmax foi reduzida pela metade. Em contraste, a mutante C53A tratada com GSNO mostrou KM e Vmax semelhantes à forma não tratada. Na desnaturação térmica de PtpA S-nitrosilada, a TM diminuiu consideravelmente na proteína selvagem, C11A e C16A, porém as mutantes C53A, C11A/C53A e C16A/C53A não tiveram mudanças significativas. Esses resultados sugerem que a S-nitrosilação ocorre especificamente na C53 não catalítica, essa alteração não afeta a afinidade pelo substrato e a S-nitrosilação da Cys53 afeta a estabilidade térmica da proteína. Por outro lado, outras duas proteínas de M tuberculosis foram estudadas, PtkA e SapM. A tirosina cinase PtkA fosforila a PtpA em dois resíduos de tirosina situados no PDYY-loop e se autofosforila na Tyr262. Neste trabalho, a PtkA recombinante foi expressa em bactérias E. coli BL21(DE3) e purificada por IMAC. Ensaios de CD revelaram que a proteína apresenta 42% de ?-hélice e 7% de folha-?, o que sugere que a proteína recombinante está corretamente enovelada. Por pertencer a família de proteínas HAD, a PtkA requer Mg2+ para a hidrólise do ATP. Foi observado que a TM da proteína aumenta consideravelmente na presença do metal, de 31 °C para 43 °C. Assim pode-se dizer que a ligação do metal ao sítio ativo estabiliza a estrutura terciária da proteína. A PtkA também é S-nitrosilada, porém o efeito dessa modificação pós-traducional sobre a atividade e estrutura da proteína ainda é desconhecido. A sequência de DNA que codifica SapM também foi inserida no vetor de expressão pET-14b. Diversas condições de expressão foram testadas sendo que se obteve maior rendimento em bactérias E. coli BL21 (DE3) pLysS na temperatura e tempo de indução de 15 °C por 20 horas. Como a proteína permaneceu na fração insolúvel do lisado bacteriano, essa teve que ser solubilizada pela adição de ureia 8M e posteriormente purificada por IMAC. As condições para o correto re-enovelamento ainda devem ser otimizadas para dar sequência à caracterização de SapM.Abstract : The S-nitrosylation of Mycobacterium tuberculosis PtpA decreases its phosphatase activity. The aim of this work is to investigate the effect of S-nitrosylation in PtpA kinetic parameters and thermal stability. By biotin switch assays it was observed that the substitution of Cys53 residue by an alanine residue in mutants C53A, C53A/C11A, C53A/C16A and C53A/C11A/C16A resulted in proteins unable to bind biotin upon NO donor treatment. It was also observed that the KM of nitrosylated PtpA was similar to its unmodified form, but the Vmax was reduced to half. In contrast, C53A treated with GSNO showed KM and Vmax similar to the untreated form. Thermal denaturation of Snitrosylated PtpA was evaluated by CD spectroscopy. When GSNO was added to PtpA, the TM decreased in wild type, C11A and C16A, while significant differences in C53A, C11A/C53A and C16A/C53A mutants were not observed. These results suggest that S-nitrosylation occurs specifically in the non-catalytic Cys53, this modification does not affect substrate affinity, and S-nitrosylated Cys53 affects protein thermal stability. Moreover, two other M. tuberculosis proteins are studied, PtkA and SapM. Tyrosine kinase PtkA phosphorylates PtpA in two tyrosine residues located in PDYY-loop and autophosphorylates at Tyr262. In this work, recombinant PtkA was expressed in E. coli BL21 (DE3), and purified by IMAC. CD experiments reveal that the protein has 42% á- helix and 7% â-sheet, which suggest that the recombinant protein is properly coiled. Like other proteins belonging to HAD family, PtkA requires Mg2+ for ATP hydrolysis. It was observed that the TM of this protein greatly increases in the presence of metal, from 31 °C to 43 °C. Thus, it can be said that the metal binding to the active site of this enzyme stabilizes the tertiary structure of the protein. It was observed that PtkA is also S-nitrosylated, but the effect of this post-translational modification on the structure and activity of the protein is still unknown. The DNA sequence encoding SapM was also inserted into the expression vector pET-14b. Various expression conditions were tested. The higher yield was obtained in E. coli BL21 (DE3) pLysS during 20 hours of induction at 15 °C. As the protein remained in the insoluble fraction of the bacterial lysate, it had to be solubilized by addition of 8M urea, and further purified by IMAC. The conditions for proper refolding still have to be optimized in order to be able to continue SapM characterizatio