Avaliação in vitro e in vivo dos efeitos da proteína óssea morfogenética tipo 2 recombinante (rhBMP-2) e de células-tronco derivadas do tecido adiposo humano na osteogênese

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2012Dentre os vários fatores de crescimento que têm sido relatados na literatura para tratamento de defeitos ósseos, as proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs) têm atraído bastante interesse, em decorrência de sua capacidade osteoindutora. As células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) também vêm se destacando na regeneração tecidual e na modulação da resposta inflamatória pelo seu efeito parácrino. O objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro e in vivo os efeitos da BMP-2 e de ASCs na osteogênese. Os experimentos se dividiram em 4 etapas, sendo: (1) avaliação do efeito da proteína óssea morfogenética recombinante humana do tipo 2 (rhBMP-2), da BMP-4 e da BMP-7 na diferenciação osteogênica de ASCs suplementadas com arcorbato e ?-glicerofosfato; (2) comparação do efeito do ácido retinóico (AR), da rhBMP-2 e da rhBMP-2+AR na diferenciação osteogênica de ASCs; (3) avaliação do efeito da implantação de ASCs incorporadas em arcabouços de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) na inflamação causada por rhBMP-2 no tecido muscular de cães; e (4) avaliação do efeito de ASCs incorporadas em arcabouços autógenos de plasma rico em plaquetas (PRP) na regeneração óssea na tíbia de cães. Os resultados confirmaram as caracterísitcas de células-tronco mesenquimais das ASCs, através da imunofenotipagem e da diferenciação adipogência e osteogênica. Em relação à etapa 1, as ASCs expressaram BMP-4 e BMP-7 endógenas, a suplementação do meio osteogênico com rhBMP-2 não aumentou a atividade de ALP, a expressão do mRNA da osteonectina e osteocalcina, e a deposição de cálcio. No que diz respeito à etapa 2, a rhBMP-2 promoveu maior expressão de Smad 1 e BMP-7 (dia 7), maior expressão relativa do mRNA do receptor de BMP do tipo II (BMPR-II) e do mRNA da osteocalcina (dia 21). Por sua vez, o AR exibiu as maiores atividades de ALP (dias 7, 14, 21 e 28), maior expressão relativa do mRNA do receptor de BMP do tipo II (RBMP-II) (dia 14), do mRNA da Smad 1 (dia 21) e do mRNA da osteonectina (dias 14, 21 e 28). A associação rhBMP-2+AR promoveu os maiores níveis de cálcio na matriz extra-celular (dias 12 e 32), a expressão da Smad 4 considerável (dias 21 e 28), expressão da Smad 1/ 5/ 8 fosforilada similar ao MC3T3-E1 (controle positivo) (dias 7, 14, 21 e 28), maior expressão relativa do mRNA da Smad 1, mRNA da osteocalcina e mRNA da osteonectina (dias 14, 7 e 7, respectivamente). Em relação à etapa 3, a agregação da rhBMP-2 aos arcabouços foi de aproximadamente 78, 74 e 61% para 1, 2,5 e 5 µg de rhBMP-2.mL-1, respectivamente. A liberação acumulada da rhBMP-2, em 21 dias, foi de aproximadamente 90, 64 e 64% para 1, 2,5 e 5 µg de rhBMP-2.mL-1, respectivamente. Os arcabouços de PLGA foram quase que totalmente degradados em 6 semanas de pós-operatório. As ASCs foram capazes de modular a resposta inflamatória causada por baixa dose de rhBMP-2 (2,5?g) no tecido muscular de cães, diminuindo o número de focos inflamatórios, células gigantes e aumentando a neovascularização. Os resultados da etapa 4 mostraram que PRP+ASCs apresentou menor quantidade de tecido de granulação e promoveu maior quantidade (osso primário e secundário) e maturação (osso secundário) de tecido ósseo neoformado nos defeitos ósseos, comparado com osso autógeno e PRP, isoladamente. Resumidamente, pode-se concluir que a suplementação da rhBMP-2 ao meio osteogênico não melhorou a osteogênese das ASCs; a associação de rhBMP-2+AR se mostrou mais eficiente na osteodiferenciação das ASCs, comparado com rhBMP-2 ou AR isoladamente; as ASCs reduziram o processo inflamatório e aumentaram a neovascularização nos sítios musculares que receberam baixa dose de rhBMP-2; e as ASCs associadas com PRP apresentaram menor quantidade de tecido de granulação e promoveram maior quantidade e maturação de tecido ósseo neoformado nos defeitos ósseos, comparado com osso autógeno e PRP.