Embriogênese secundária, caracterização bioquímica e histoquímica de culturas embriogênicas de Ocotea catharinensis (Mez.) (Lauraceae)

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia VegetalOcotea catharinensis Mez. (Lauraceae) é uma arvore nativa da Floresta Atlântica, localizada no sul do Brasil, que se encontra atualmente na lista de espécies ameaçadas de extinção, devido à importância econômica da madeira, que é utilizada na fabricação de móveis e casas. Um sistema de embriogênese somática de alta frequência foi desenvolvido para esta espécie, a fim de solucionar o problema da produção esporádica de sementes, cuja viabilidade é reduzida drasticamente após poucos meses de armazenamento. Os objetivos deste trabalho foram caracterizar as culturas de células embriogênicas dos tipos friável, diferenciada 1 e diferenciada 2 e de embriões somáticos no estágio cotiledonar de Ocotea catharinensis quanto ao crescimento, perfil metabólico, metabólitos secundários, potencial de embriogênese secundária e histoquímica. A análise de dissimilação de carbono apresentou um padrão linear para as culturas de células embriogênicas do tipo diferenciada 2 crescidas em meio de cultura com sacarose, enquanto com glucose o padrão foi variável. A espectroscopia por FT-IR deste tipo de cultura permitiu comparar o perfil metabólico primário e secundário dos extratos, evidenciando diferenças qualitativas em nível molecular. A análise de componentes principais (PCA) de varreduras UV-Vis, evidenciou grupos característicos em função das concentrações de compostos fenólicos. Estes resultados reforçaram os obtidos nas dosagens de carotenóides e compostos fenólicos. As culturas de células embriogênicas do tipo diferenciada 2 apresentaram as maiores concentrações de carotenóides, enquanto que os embriões somáticos, no estágio cotiledonar, apresentaram a maior concentração de compostos fenólicos. Culturas de células embriogênicas do tipo diferenciada 2, crescidas por 3 e 4 semanas apresentaram maior concentração de carotenóides mas as concentrações de compostos fenólicos se mantiveram constantes nas 6 semanas de cultivo. As culturas de células crescidas em meio de cultura WPM com 58,4 mM de sacarose e glutamina apresentaram a maior concentração de carotenóides, e juntamente com 116,8 mM de glucose e glutamina, a maior concentração de compostos fenólicos. Houve forte correlação entre a concentração de compostos fenólicos e atividade antioxidante ao longo das semanas de cultivo. A capacidade antioxidante dos diferentes tipos de culturas de células não apresentou correlação com a concentração de compostos fenólicos. Estruturas de culturas de células embriogênicas do tipo 2 desidratadas por uma semana apresentaram 98,35% de embriogênese secundária e por duas semanas apresentaram 88,66%. A embriogênese secundária foi estimulada em meio de cultura WPM, com 58,4 mM de sacarose e 116,8 mM de glucose, ambos com sorbitol e glutamina, apresentando as maiores porcentagens de embriogênese secundária (88,66% e 83,97%, respectivamente). A adição de frutose no meio de cultura inibiu a embriogênese secundária. O meio de cultura MS não apresentou resultados satisfatórios. Estruturas de culturas de células embriogênicas desidratadas por 2 semanas a 25ºC, seguido de 2 semanas a 5ºC, apresentaram maior porcentagem de embriogênese secundária, quando comparadas com as desidratadas por 4 semanas a 25ºC. A ausência de luz reduziu significativamente a embriogênese secundária. A avaliação do crescimento das culturas de células embriogênicas e a análise de metabólitos primários e secundários, através de espectroscopia de UV-vis e FT-IR, fornecem suporte para a otimização das culturas de células embriogênicas, identificação e seleção de diferentes tipos de culturas de células com potencial para a produção de compostos de interesse.Ocotea catharinensis Mez. (Lauraceae) is a native tree from the Atlantic rainforest located in southern Brazil, and it is currently on the list of species threatened with extinction due to its economic importance, its wood is used for furniture and houses. A high-frequency somatic embryogenesis system has been developed for this species in order to solve the problem of sporadic seed production, whose viability is drastically reduced over a few months of storage. The aims of this study was to characterize the different types of embryogenic cell cultures (friable, differentiated 1, differentiated 2) and mature cotyledonary somatic embryos of Ocotea catharinensis concerning its in vitro growth, metabolic profile, secondary metabolites, secondary embryogenesis potential and hystochemistry. The FT-IR spectroscopy and UV-vis spectrophotomery allowed the comparison of the primary and secondary metabolism profiles, showing qualitatives differences at molecular level. The analysis of this kind of culture allowed compares the primary and secondary metabolic profile of extracts, showing qualitative differences at the molecular level. FT-IR spectroscopy and UV-Vis spectrophotometry, showed the profile of phenolic compounds and carotenoids and the antioxidant activity from these extracts. The effect of dehydration period, low temperature, presence and absence of light source, sugar alcohols and carbon sources on secondary somatic embryogenesis.The carbon dissimilation analysis showed a linear pattern to somatic embryos growth in the presence of sucrose, while with glucose, the pattern is variable. FTIR spectroscopy allowed the comparison between primary and secondary metabolic profile extracts, and showed qualitative differences at molecular level. The principal component analysis (PCA) of UV-Vis screen showed characteristic groups, which were grouped due to the concentrations of phenolic compounds. These results strengthened those obtained in the measurement of carotenoids and phenolic compounds. The embryogenic cell cultures type differentiated 2 had the highest concentrations of carotenoids, while somatic embryos at cotyledonary stage the highest concentration of phenolic compounds. Embriogenic cell cultures type differentiated 2, with 3 and 4 weeks had higher carotenoid concentration, whilst, phenolic compounds concentrations remained constant during the six weeks of culture. The cell cultures grown on WPM medium containing 58,4 mM of sucrose and glutamine had the highest concentration of carotenoids, and along with 116,8 mM glucose and glutamine had the highest concentration of phenolic compounds.There was a strong correlation between the concentration of phenolic compounds and antioxidant activity over the culture periods. The concentration of phenolic compounds was not correlated with the antioxidant capacity of the different types of embryogenic cell cultures. Dehydrated embryogenic structures produced by the cell cultures type differentiated 2 for one week showed 98.35% of secondary embryogenesis and two weeks showed 88,66%. WPM media supplemented with 58,4 mM of sucrose and 116,8 mM of glucose, both with sorbitol and glutamina, showed the highest percentage of secondary embryogenesis (88,66% and 83,97% respectively). The addition of fructose in the culture medium inhibited secondary embryogenesis. MS medium has not shown satisfactory results on secondary embryogenesis. Embryogenic structures dehydrated for 2 weeks at 25°C, followed by 2 weeks at 5°C, showed the highest percentage of secondary embryogenesis when compared to those dehydrated for 4 weeks at 25°C.The absence of light significantly decreased secondary embryogenesis. The evaluation of growth of somatic embryos, primary and secondary metabolites analysis through the UV-vis and FT-IR spectroscopy, provide the backgroung for further studies on embryogenic cell cultures optimization, identification and selection of cultures with potential to produce compounds of economic interest