Detecção molecular do DNA e RNAm do HPV e sua aplicabilidade na triagem do câncer cervical

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2011O câncer de colo uterino representa o segundo tipo de câncer mais comum entre as mulheres. As estimativas mundiais sobre incidência e mortalidade por este câncer são de 493.000 casos/ano e 288.000 óbitos/ano, sendo a incidência maior em países em desenvolvimento. No Brasil, para o ano de 2010, segundo dados do Instituto Nacional do Câncer (INCA) estimou-se 18.430 novos casos. O rastreamento do câncer cervical é baseado na citologia oncótica, entretanto este é um método subjetivo, com um grau variável de resultados falso-negativos e falso-positivos. Estudos epidemiológicos e experimentais demonstram importante associação entre o Papiloma Vírus Humano (HPV) e o câncer de colo uterino, observando que este agente está presente em 99,7% dos casos. Este estudo detectou o DNA do HPV pela PCR (PCRHPV) utilizando os iniciadores consenso MY09/MY11 e nested PCR com os iniciadores GP5+/GP6+, a expressão de E6/E7 RNAm dos tipos de HPVs de alto risco 16, 18, 31, 33 e 45 pela metodologia NASBA (NucliSens ® HPV EasyQ 1.0-BioMérieux, France) e identificou os principais tipos virais: 6, 11, 16, 18, 31, 33 e 45 pela PCR-HPVte. Os resultados foram comparados com a citologia oncótica para estimar o rendimento da PCR e a contribuição da expressão de E6/E7 RNAm ao diagnóstico precoce do câncer cervical na população do estudo. Foram estudadas 162 amostras cervicais de mulheres atendidas em Florianópolis. A sensibilidade encontrada para a detecção do DNA-HPV pela PCR foi de 90,6%, especificidade de 74,6%, VPP de 46,8% e VPN de 97%. O DNA do HPV pela PCR foi detectado em 38,3% (62/162) das amostras, em 90,6% (29/32) das citologias classificadas como positivas (ASC-US +) e em 25,4% (33/130) das citologias classificadas como negativas. A expressão de E6/E7 RNAm foi detectada em 13,6% (22/162) das amostras, dessas 6,9% (9/130) foram classificadas como citologia negativa. A PCR-HPVte identificou o tipo viral em 37,1% (23/62) das amostras. Os tipos de HPVs mais frequentes do estudo considerando-se a expressão de E6/E7 RNAm e a PCR-HPVte foram: HPVs: 16 (12,5%), 33 (10,9%), 18 (7,8%), 6 (6,3%), 31 (4,7%), 45 (4,7%) e 11 (1,6%). Das 22 amostras que expressaram E6/E7 RNAm 15 eram de pacientes com idade inferior a 30 anos. De acordo com os dados encontrados neste estudo, consideramos importante, no Brasil, a mudança das estratégias de rastreamento com a associação da PCR-HPV à citologia oncótica, pois esta parece ser uma alternativa economicamente viável. A identificação das pacientes com DNA HPV positivas seguidas da determinação do tipo viral pelo método da PCR HPVte, ou realização da expressão de E6/E7 RNAm poderá contribuir com o diagnóstico precoce do câncer cervical, assim como na elaboração e no desenvolvimento de vacinas anti-HPV. A possibilidade de intervenção precoce, além de salvar vidas pode ser uma medida de economia para o SUS.The Cervical cancer is the second more frequent type of cancer in women worldwide. The majority of cases occur in the developing world and it is the leading cause of cancer mortality in women. In Brazil, was estimated the occurrence of 18.430 new cases for 2010. The cervical screening is based on cytology; however it is subject of a substantial degree of false-negative and false-positive results. Epidemiological and experimental studies have demonstrated an important association between Human Papilloma Virus (HPV) and cervical cancer, noting that this agent is present in 99.7% of cases. This study detected HPV DNA by PCR (PCR-HPV), the expression of mRNA E6/E7 by the NASBA method (NucliSens ® HPV EasyQ 1.0-BioMérieux, France) and identified major viral types 6, 11, 16, 18 31, 33 and 45 by PCR-HPVte. The results were compared with cytology to estimate the yield of PCR and mRNA E6/E7 expression contribution to early diagnosis of cervical cancer in the study population. We studied 162 cervical samples of women from Florianopolis city, Brazil using the consensus primers MY09/MY11 and nested PCR with the primers GP5+/GP6+ to detect generic HPV, the oncogene expression of proteins E6/E7 mRNA to high-risk 16, 18, 31, 33 and 45 HPV types by NASBA (NucliSens ® HPV EasyQ 1.0-bioMérieux, France) and identified major viral types 6, 11, 16, 18, 31, 33 and 45 by PCR-HPVte. Our study found to PCR-HPV a sensitivity of 90.6%, a specificity of 74.6%, a PPV of 46.8% and a NPV of 97%. HPV DNA was detected in 38.3% (62/162) of samples, corresponding to 90.6% (29/32) of cytology positive (ASC-US +) and 25.4% (33/130) of cytology negative. The mRNA E6/E7 expression was detected in 13.6% (22/162), 6.9% (9/130) of these with negative cytology. The PCR-HPVte identified viral type in 37.1% (23/62) of samples. The most frequent HPV types found, considering the expression of mRNA E6/E7 and PCR-HPVte were: 16 (12.5%), 33 (10.9%), 18 (7.8%), 6 (6.3%), 31 (4.7%), 45 (4.7%) e 11 (1.6%). Of the 22 samples that expressed mRNA E6/E7 15 were from patients younger than 30 years. According to the data found in this study, we consider important in Brazil, change the screening strategies with the combination of PCR-HPV with the cytological analysis, as this seems to be an economically viable alternative. The identification of patients with positive HPV DNA followed by the determination of viral type by the CR-HPVte or detection of the E6/E7 oncogene expression may contribute to the early diagnosis of cervical cancer, as well as in formulating and developing strategies for vaccine#HPV. The possibility of early intervention, save lives and can be a cost-saving measure for the Brazilian Unified Health System