Estudo da resistência de Pneumocystis jirovecii ao cotrimoxazol em doentes com infecção VIH SIDA

Pneumocystis jirovecii é um eucariota responsável por um quadro clínico de pneumonia intersticial grave em indivíduos imunocomprometidos. Apesar do decréscimo da incidência da pneumonia por P. jirovecii (PPc) como resultado da introdução da profilaxia específica e da terapêutica antirretroviral potente (HAART, do inglês “Highly active antiretroviral therapy”), esta doença continua a ser uma das infecções oportunistas mais frequentes em doentes com infecção vírus da imunodeficiência humana/síndroma de imunodeficiência adquirida (VIH/SIDA) e com outras imunodeficiências. Os fármacos da família das sulfas, em especial o cotrimoxazol, uma combinação de sulfametoxazol e de trimetoprim, são considerados os agentes de primeira linha na profilaxia e no tratamento desta infecção. Ao longo dos últimos anos, tem sido estudada a variabilidade genética da dihidropteroato sintetase (DHPS) e da dihidrofolato reductase (DHFR), duas enzimas alvo do cotrimoxazol, de P. jirovecii com o intuito de avaliar o possível desenvolvimento de resistência a este fármaco. Por outro lado, o estudo de outros marcadores genéticos, como as regiões dos espaçadores internos transcritos (ITS, do inglês "Internal Transcribed Spacers"), em conjunto com o DHPS e o DHFR, tem sido utilizado no sentido de melhor compreender os mecanismos de desenvolvimento de resistência ao cotrimoxazol. Com o presente estudo, pretendeu-se efectuar a caracterização genética da DHPS, da DHFR e das regiões ITS de P. jirovecii, em isolados obtidos entre 1995 e 2004, em doentes imunocomprometidos. Também foi objectivo deste trabalho, estudar a relação dosgenótipos identificados nas três regiões genómicas em análise, entre si e com diversas variáveis clínicas e epidemiológicas. Entre os 403 isolados de P. jirovecii, obtidos entre 2001 e 2004, a percentagem de infecção por P. jirovecii observada foi de 64,5%. No total, 290 isolados de P. jirovecii identificados no período de 2001–2004 (260 isolados) e entre 1995–2000 (30 isolados), foram submetidos ao estudo de caracterização genética, nos três loci em estudo. Inicialmente, com o intuito de melhorar a técnica de amplificação do gene da DHPS de P. jirovecii, procedeu-se á filtração das amostras de secreções pulmonares, para remoção de DNA do hospedeiro contaminante, e foi elaborado um novo protocolo de amplificação. Apesar, de se ter verificado que o processo de microfiltração não promovia uma melhor amplificação de DNA específico de Pneumocystis, o protocolo de PCR “nested” desenhado contribuiu para a maior amplificação do gene da DHPS de P. jirovecii (P <0,001). A caracterização genética da DHPS e da DHFR, permitiu identificar o genótipo selvagem em 84,5% e 68,9%, respectivamente, dos isolados estudados. Em 15,5% dos isolados, observou-se a presença de genótipos mutantes nos codões 55 e 57 do gene da DHPS. Em relação ao gene da DHFR, 31,1% dos isolados apresentaram polimorfismos. No total, foram identificados nove locais de substituição: quatro substituições sinónimas, nas posições nucleotídicas 201, 272, 312 e 381; cinco substituições nucleotídicas não sinónimas nas posições 38, 68, 92, 154 e 200 que resultaram na alteração nos codões 13, 23, 31, 52 e 67, respectivamente. No estudo efectuado, verificou-se que as mutações do gene da DHPS, foram mais frequentes entre os isolados obtidos em 1995-2000 do que entre os isolados recolhidos entre 2001 e 2004 (P=0,056). Relativamente ao gene da DHFR e, em contraste com a maioria dos estudos publicados, observou-se uma elevada diversidade genética entre os isolados estudados.Também, nas regiões ITS de P. jirovecii, foi observada uma elevada variabilidade entre os isolados estudados. No presente trabalho, 30 genótipos diferentes foram identificados, o que evidencia o elevado grau de diversidade genética destas regiões e a sua utilidade no estudo da transmissão e da epidemiologia da PPc. No estudo efectuado, os genótipos mais frequentes foram o Eg, o Cg e o Gg. Verificou-se que o genótipo Ne foi significativamente mais frequente entre 1995–2000 (P= 0,026) enquanto que o genótipo Eg foi mais frequente entre 2001–2004 (P=0,011). Considerando a combinação dos genótipos identificados nestas três regiões genómicas, foram observados 50 haplótipos distintos em 100 isolados de P. jirovecii. A elevada diversidade intra-específica observada neste estudo multilocus demonstra o potencial que esta abordagem pode ter na diferenciação de tipos P. jirovecii distintos e a sua utilidade no estudo da transmissão e da epidemiologia da PPc. No estudo efectuado, polimorfismos nos genes da DHPS e da DHFR, presumidamente associados à exposição ao cotrimoxazol, foram detectados em doentes não expostos a este fármaco. Esta observação pode sugerir que estas sequências polimórficas possam ser adquiridos acidentalmente, por transmissão pessoa-a-pessoa ou através de uma fonte ambiental, e não somente por pressão selectiva do cotrimoxazol. Também, a identificação de genótipos idênticos, nas três regiões genómicas em estudo, em diferentes populações de doentes sugere a ocorrência de transmissão pessoa-a-pessoa. No geral, o presente trabalho contribuiu para a clarificação do papel das mutações nos genes da DHPS e da DHFR no possível desenvolvimento de resistência ao cotrimoxazol em P. jirovecii assim como para a melhor compreensão da transmissão e da epidemiologia da PPc.Pneumocystis jirovecii is an eukaryote that causes severe interstitial penumonia in immunocompromised patients. Although the widespread use of P. jirovecii pneumonia (PcP) chemoprophylaxis and highly active antiretroviral therapy (HAART), has reduced the incidence of this infection it remains an important opportunistic infection in acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and other immunocompromised patients. Sulpha drugs, in particular cotrimoxazole, the fixed combination of sulphamethoxazole and trimethoprim, are key agents for treatment and prophylaxis of PcP. Over the last years, the genetic variability of P. jirovecii dihydropteroate synthase (DHPS) and dihydrofolate reductase (DHFR), the enzimatic targets of cotrimoxazole, has been evaluated in order to assess the potential development of resistance to this drug. Also, the study of other genetic markers, like the internal transcribed spacers (ITS) of the nuclear rRNA, together with the DHPS and DHFR genes, has been used in order to improve the knowledge on the mechanisms involved in the development of cotrimoxazole resistance in P. jirovecii. In the present study, the main objective was to perform the genetic characterization of DHPS, DHFR and ITS regions of P. jirovecii isolates obtained between 1995 and 2004, from immunocompromised patients. Also, we intended to study the association between the genotypes identified at the three genomic regions and with several epidemiological and clinical characteristics. Overall, among the 430 P. jirovecii isolates obtained between 2001 and 2004, the frequence of P. jirovecii infection was 64,5%. Overall, 290 P. jirovecii isolates, obtained inthe time periods 1995–2000 (30) and 2001–2004 (260), were submitted to the multilocus molecular characterization study. Initially, in order to improve the amplification method of the DHPS gene, a microfiltration procedure, for the removal of human cell contamination, and a new PCR method, for amplification in specimens with low parasite load, were evaluated. Although, the microfiltration procedure did not promote the amplification of P. jirovecii specific DNA, a higher amplification rate of DHPS gene was obtained with the “nested” PCR method designed (P < 0,001). In the present work, the genetic characterization of P. jirovecii DHPS and DHFR identified the wiltype genotype in 84,5% and 68,8%, respectively, of the isolates studied. In 15,5% of the isolates, the mutant genotypes at codons 55 and 57 of the DHPS gene was observed. In the DHFR gene, 31,1% of the isolates presented polymorphic sequences with a total of nine substitution sites identified. Four synonymous substitutions, at nucleotide positions 201, 272, 312 and 381 were observed. Also, five nonsynonymous substitutions at nucleotide positions 38, 68, 92, 154 and 200, that lead to amino acid alterations at codons 13, 23, 31, 52 and 67, respectively, were detected. In this study, DHPS mutant sequences were more frequent among the isolates collected between 1995 and 2000, compared with the isolates collected in the time period 2001–2004 (P=0,056). In the DHFR gene, a high genetic diversity was observed in the isolates studied, in contrast with other reports. Also, in the P. jirovecii ITS regions, a high genetic heterogeneity was detected in the studied isolates. In the present work, 30 different genotypes were identified, which demonstrates the high genetic diversity at this locus and confirms their great utility in the study of PcP epidemiology and transmission. In this study, the most frequent genotypeswere Eg, Cg and Gg. Genotype Ne was significantly more frequent between 1995 and 2000 (P=0,026) while type Eg was more frequent in the time period 2001–2004 (P=0,011). Combining the sequences identified at these three genomic regions, 50 different haplotypes were observed among 100 P. jirovecii isolates. The great intra-specific genetic diversity observed in the multilocus study demonstrates the potential of this analysis to distinguish different types of P. jirovecii and its utility in the study of PcP epidemiology and transmission. In the present study, DHPS and DHFR polymorphisms, presumably selected by cotrimoxazole pressure, were detected in imunocompromised patients not exposed to this drug. This observation may suggest that these polymorphic sequences may be incidentally acquired, by person-to person transmission or from an environmental source, and not only by drug selective pressure. Also, the observation of common genotypes, identified at the three genomic regions studied, present in different patients’ populations, suggests the occurrence of person-to-person transmission. Overall, the present work contributed to the clarification of the role of polymorphic sequences of the DHPS and DHFR in the potential development of P. jirovecii cotrimoxazole resistance and in the improvement of PcP epidemiology and transmission