Produção e caracterização de anticorpos monoclonais contra o vírus rábico

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010Os primeiros anticorpos monoclonais (AcM) contra o vírus rábico foram produzidos por Wiktor e Koprowski em 1978 e, desde então, diversos outros foram produzidos e descritos. No entanto, apesar do grande número de AcM antirrábicos descritos na literatura, eles nem sempre são facilmente obtidos, principalmente porque a produção de AcM no Brasil é bastante limitada. Ademais, devido à grande diversidade de variantes de vírus rábico existentes no Brasil, torna-se importante produzir novos AcM que possam atender a interesses mais específicos. Assim, o objetivo do presente trabalho foi a produção e caracterização de AcM contra o vírus rábico. Para tanto, foram realizados cinco protocolos de imunização, nos quais camundongos Balb/c foram imunizados com os seguintes antígenos: (1) vacina antirrábica (VeroRab®, Aventis-Pasteur) para uso em humanos; (2) suspensão inativada de tecido de sistema nervoso central de camundongos infectados com vírus rábico selvagem isolado de um bovino naturalmente infectado por morcego hematófago em Passos de Torres/SC; (3) fragmento recombinante da glicoproteína do vírus rábico cepa ERA compreendendo os aminoácidos 179 a 281 (denominado rGERA179-281) seguido da inoculação de vírus rábico cepa PV na pata; (4) rGERA179-281 seguida por um reforço com a mesma proteína ou com vírus rábico cepa PV; (5) rGERA179-281 e vacina VeroRab®. Esplenócitos dos camundongos imunizados foram fusionados com células de mieloma da linhagem P3X63Ag8.653 utilizando polietilenoglicol 4000 e os hibridomas secretores de anticorpos antirrábicos foram triados por imunofluorescência indireta em células BHK-21 infectadas com vírus rábico. Diluições limitantes foram realizadas e sete clones estáveis foram obtidos, sendo denominados LIA 02 (fusão 1), 6H8 e 7B7 (fusão 2) e 3E6, 8D11, 9C7 e 8B6 (fusão 3). Nos dois últimos protocolos, não foram obtidos hibridomas secretores de anticorpos antirrábicos estáveis. Dentre os AcM, três foram caracterizados como IgG2a (6H8, 8D11 e 8B6), dois como IgM (7B7 e 9C7), um como IgG2b (LIA 02) e um como IgG3 (3E6), todos com cadeia leve kappa. Por ensaio de neutralização, foi verificado que o AcM 8D11 foi capaz de neutralizar o vírus rábico cepa PV in vitro. Além disso, o 7B7 reconheceu a rGERA179-281 e apenas o 8D11 não reconheceu o vírus presente na vacina VeroRab®, conforme demonstrado por ELISA. Os AcM também foram testados contra vírus rábico selvagem isolado de diferentes animais (bovinos, equinos, morcegos, cães e canídeos silvestres) e de humano (uma amostra) oriundas de diferentes regiões do Brasil. O AcM 6H8 reconheceu todas as amostras testadas. Os AcM LIA 02, 3E6 e 9C7 juntos também reconheceram todas elas. Assim, a partir dos resultados obtidos neste trabalho, novos estudos utilizando esses AcM como ferramentas biotecnológicas poderão ser desenvolvidos