Atividade oxidativa e não oxidativa de células fagocitárias expostas a protozoários do género Leishmania

As leishmanioses, causadas por protozoários do género Leishmania, são um problema de saúde pública e veterinária. No homem, a doença classifica-se clinicamente em leishmaniose cutânea, visceral e mucocutânea. A leishmaniose cutânea pode ser produzida por L. amazonensis, L. shawi e L. guyanensis, entre muitas outras espécies. A leishmaniose visceral zoonótica causada por L. infantum apresenta manifestações clínicas graves que podem ser fatais. Neutrófilos ou células polimorfonucleares (PMN) têm função crucial na imunidade inata, sendo as primeiras a ser recrutadas para o local de infeção. Os monócitos/macrófagos (MФ) desempenham o duplo papel de serem células fagocíticas apresentadoras profissionais de antigénios e as hospedeiras por excelência de Leishmania. O presente trabalho teve como objetivo analisar a atividade leishmanicida de neutrófilos de murganhos BALB/c e de MФ (linha celular P388D1 derivada de murganhos) quando expostos in vitro a espécies de Leishmania do subgénero Leishmania (L. infantum e L. amazonensis) e Viannia (L. shawi e L. guyanensis) através da avaliação da (i) expressão dos sensores celulares NOD1, NOD2, TLR2, TLR4 e TLR9 por real time PCR, (ii) ativação dos mecanismos oxidativos (superóxido nos neutrófilos e óxido nítrico e ureia nos MФ), (iii) importância dos mecanismos enzimáticos e (iv) produção de NET por neutrófilos. Estudo idêntico foi realizado em neutrófilos e MФ de canídeos infetados in vitro com L. infantum. Neutrófilos de murganhos internalizam parasitas dos subgéneros Leishmania e Viannia. Os mecanismos oxidativos e enzimáticos são ativados e geradas NET, contribuindo para o controlo da infeção. No entanto, o contato com os parasitas não promove a expressão génica dos sensores celulares. MФ P388D1 fagocitam as diferentes espécies de Leishmania, porém não ocorre ativação da via clássica, mas sim da via alternativa, assegurando a sobrevivência intracelular do parasita. Nestas células, a exposição às diferentes espécies de Leishmania conduziu a aumentos pontuais da expressão génica de NOD1 e TLR2 e também de TLR9, com exceção de L. shawi. No entanto, as espécies do subgénero Viannia induziram aumento da expressão génica de NOD2. Em conjunto, estes resultados sugerem que cada espécie elabora estratégias próprias de ativação dos sensores celulares. Os neutrófilos caninos também internalizaram L. infantum, ativaram os mecanismos oxidativos e produziram NET capazes de aprisionar extracelularmente promastigotas. Porém, apenas ocorreu exocitose da elastase neutrofilica sugerindo que este parasita restringe a actividade enzimática de neutrófilos. MФ caninos infetados por L. infantum ativaram a via alternativa e apresentaram unicamente expressão aumentada de TLR2, o que desencadeia a ativação dos mecanismos oxidativos e produção de citocinas pró-inflamatórias. Este estudo contribuiu para clarificar o efeito da infeção por espécies cutâneas e viscerais de Leishmania na ativação dos mecanismos oxidativos e não oxidativos das células fagocitárias de canídeos e modelo roedor. Foi demonstrado pela primeira vez que a infeção por Leishmania spp. na célula hospedeira está intimamente associada ao aumento da expressão de TLR2 e, consequentemente, à provável ativação desta via metabólica. A compreensão dos fatores que inibem ou estimulam os sensores celulares de imunidade inata, cruciais no reconhecimento do parasita, pode ser importante no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a leishmaniose.Caused by protozoa of the genus Leishmania, leishmaniases, are considered an important public health issue and a veterinary disease. In humans, the disease can be clinically classified into cutaneous, visceral and mucocutaneous leishmaniasis. Cutaneous leishmaniasis can be produced by L. amazonensis, L. shawi and L. guyanensis among many others species. The zoonotic visceral leishmaniasis caused by L. infantum presents severe clinical manifestations that can be fatal if left untreated. Neutrophils or polymorphonuclear cells (PMN) play a crucial role in innate immunity, being the first cells to be recruited to the site of infection. Monocytes/macrophages (MФ) play the dual role of being phagocytic and antigenic presenting cells and the definitive host cells of Leishmania parasite. This study was designed to investigate the leishmanicidal activity of neutrophils isolated from BALB/c mice and of MФ (cell line P388D1 differentiated from mice) exposed in vitro to two species of subgenus Leishmania (L. amazonensis and L. infantum) and two species of subgenus Viannia (L. shawi and L. guyanensis) by evaluating (i) gene expression of cell sensors NOD1, NOD2, TLR2, TLR4 and TLR9 through real time PCR, (ii) the activation of oxidative mechanisms (superoxide by neutrophils and nitric oxide and urea by MФ), (iii) the importance of enzymatic mechanisms and (iv) the production of NET by neutrophils. Similar studies were carried out in dog’ neutrophils and MФ infected in vitro by L. infantum. Murine neutrophils were able to internalize parasites of Leishmania and Viannia subgenera. Oxidative and enzymatic mechanisms were activated and NET were generated, leading to control of infection. However, the parasite did not induced the gene expression of cell sensors. MФ P388D1 phagocytosed the different species of Leishmania although without activating the macrophage classical pathway. Instead, parasites activated the MФ alternative pathway, ensuring intracellular survival. In such cells, the exposition to the different species of Leishmania leaded to transient increase NOD1 and TLR2 gene expression and, also of TLR9 with the exception of L. shawi. However, only the species of the subgenus Viannia caused the increase of NOD2 gene expression. Taken together, these results suggest that each parasite species develop their own strategy to promote or, by he contrary to avoid the activation of cell sensors. Dog neutrophils also internalized L. infantum parasites, activatedoxidative mechanisms and generated NET able to ambush extracellular promastigotes. However, only occurs exocytosis of neutrophilic elastase, suggesting that this parasite restricts the enzymatic activity of neutrophils. Dog MФ L. infantum-infected activated the alternative pathway and enhanced the gene expression of TLR2, stimulating oxidative mechanisms and the production of pro-inflammatory cytokines. This study sheeds light on the effect of cutaneous and visceral Leishmania parasites in the activation of oxidative and non-oxidative mechanisms of mice and dog phagocytic cells. It is also demonstrated for the first time that the establishment of infection by Leishmania spp. in the definitive host cell is closely associated with the increase of TLR2 gene expression and likely, by the activation of this metabolic pathway. Understanding the factors that inhibit or, by the contrary, stimulate innate cell sensors, which are crucial for parasite recognition, might be important in the development of new therapeutic strategies for leishmaniasis