Desenvolvimento de novas estratégias metodológicas para avaliação de compostos com potencial terapêutico para a tuberculose e outras micobacterioses

A multirresistência aos antibióticos em micobactérias, em particular Mycobacterium tuberculosis, é hoje um problema de saúde pública global. Atualmente, para além da ocorrência de mutações, o efluxo de antibióticos é considerado um importante fator no desenvolvimento de resistência, abrindo novas perspetivas no desenho de esquemas terapêuticos para as infeções causadas por estirpes resistentes, nomeadamente pela combinação de antibióticos e inibidores de efluxo. Nesta Dissertação, foi desenhado um modelo para rastreio e identificação de compostos com atividade antimicobacteriana e/ou inibitória de efluxo, usando duas estirpes isogénicas de Mycobacterium smegmatis; mc2155 (estirpe selvagem) e XZL1675 (mc2155 ΔlfrA), que diferem entre si na capacidade de efluxo, devido à deleção parcial da bomba de efluxo LfrA. Neste modelo, os compostos são avaliados através da determinação da sua concentração mínima inibitória (CMI) e da capacidade, a uma concentração subinibitória, de redução de CMIs de antibióticos e brometo de etídio (EtBr). Os compostos com CMIs baixas (20 M) são classificados como potenciais antimicobacterianos, enquanto aqueles capazes de reduzir (≥ 4x) a CMI de outros compostos são classificados como potenciais adjuvantes. Dentro destes, a redução da CMI do EtBr, um substrato comum de bombas de efluxo, em conjunto com ensaios fluorométricos, são utilizados para distinguir potenciais inibidores de efluxo. Efeitos de sinergismo entre os restantes potenciais adjuvantes e os antibióticos são avaliados por ensaios de “checkerboard”. O modelo foi testado utilizando os compostos de referência clorpromazina, tioridazina e verapamil. Como esperado, o verapamil demonstrou ser o inibidor de efluxo mais eficaz, enquanto a clorpromazina e tioridazina apresentaram atividade antimicobacteriana e de inibição de efluxo moderadas. De seguida, o modelo foi aplicado a três novos compostos, um fenilimidazolo (Q-15.252), que apresentou apenas atividade antimicobacteriana moderada e dois tiazoisoxazolos (EA156 e EA160), que apresentaram atividade inibitória de efluxo, que no caso de EA160, foi superior à do verapamil. Em conclusão, o modelo desenhado permite um rastreio rápido e económico de um elevado número de compostos em condições de biossegurança e a identificação de potenciais antimicobacterianos ou inibidores de efluxo, como o composto EA160.Drug resistant mycobacteria, particularly Mycobacterium tuberculosis, are major challenges to global public health. Besides mutation, efflux is now being recognized as a major driving force towards development of resistance to antibiotics in mycobacteria. This demands for alternative therapeutic regimens to fight infections caused by resistant strains, such as the combination of antibiotics and efflux inhibitors. In this work, we build a model for the rapid screening and identification of compounds with antimycobacterial and/or efflux inhibitory activity, using two isogenic strains of the fast growing Mycobacterium smegmatis; mc2155 (wild-type) and XZL1675 (mc2155 ΔlfrA), which differ in efflux capacity due to a partial deletion of the LfrA efflux pump. In this model, compounds are first evaluated by minimum inhibitory concentration (MIC) determination and assessment of their ability, at a sub-inhibitory concentration, to reduce MICs of antibiotics and ethidium bromide (EtBr). Compounds showing low MICs (20 M) are categorized as potential antimycobacterials, while those able to promote MIC reductions (≥ 4-fold) of other agents are classified as potential adjuvants. Within these, reduction of the MIC of EtBr, a common substrate of efflux systems, together with efflux fluorometric assays are used to distinguish potential efflux inhibitors. Synergy between the other adjuvants and antibiotics is evaluated by checkerboard assays. The model was tested with the reference compounds chlorpromazine, thioridazine and verapamil. As expected, verapamil showed the highest efflux inhibitory activity, whereas chlorpromazine and thioridazine showed moderate antimycobacterial activity and efflux inhibitory capacity. We then applied the model to three new compounds; a phenylimidazole (Q-15.252), and two thiazoisoxazoles (EA156 and EA160). Compound Q-15.252 presented mild antimycobacterial activity but no adjuvant effect, whereas the molecules EA156 and EA160 showed significant efflux inhibitory capacity, particularly EA160. In sum, the experimental model developed allows the rapid and inexpensive screening of high number of compounds in biosafety conditions and to identify potential new antimycobacterials or efflux inhibitors, such as EA160