Crosslinked Hyaluronic Acid nanoparticles as delivery vehicles for dendritic cell-targeted vaccines

RESUMO: O sistema imunitário tem sido o alvo dos mais recentes avanços no tratamento do cancro. Imunoconjugados, terapias direcionadas e imunoterapias são as classes de medicamentos mais investigados no tratamento do cancro, com muitos candidatos a fármacos atualmente em fase de desenvolvimento pré-clínico e fase final de desenvolvimento clínico. Terapias focadas em células dendríticas (CDs) são muito promissoras, uma vez que as CDs são células apresentadoras de antigénios, o que as transforma em alvos interessantes para controlar a resposta imune aquando da presença de células cancerígenas. Considerando que os antigénios sobre expressos pelas células cancerígenas podem ser apresentados às CDs induzindo uma resposta imune protetora contra o cancro, é fundamental investigar um veículo de transporte com afinidade para as DCs, bem como definir o biomaterial certo para transportar os antigénios (ou frações do antigénio) para o ambiente circundante, onde as CDs existem e onde pode ser induzida a sua maturação. Hipotetizámos o desenvolvimento de um sistema de nanopartículas para a entrega e direcionamento de um candidato terapêutico, nomeadamente um antigénio ou suas frações, numa formulação utilizando um polímero biodegradável, um veículo não tóxico que pudesse melhorar a biodisponibilidade do agente biológico, aumentando as capacidades de segmentação de uma formulação farmacêutica. O ácido hialurónico (AH) foi o biopolímero escolhido devido às suas propriedades viscoelásticas, a sua afinidade para os recetores de superfície das CDs, como o CD44 e para os recetores TLR induzindo assim a sua ativação e consequente migração para os linfócitos T nos gânglios regionais. O principal objetivo desta tese foi encontrar um método eficaz de produzir nanopartículas de AH através de um novo método de reticulação, procedendo à sua caracterização por Nanoparticle Traking Analysis, obtendo informação relativa à dimensão das partículas, concentração e distribuição das dimensões. A toxicidade do sistema de nanopartículas foi avaliada posteriormente utilizando PBMCs e analisada por câmara de Neubauer e citometria de fluxo. A nossa pesquisa demonstra que é possível produzir nanopartículas de AH de acordo com o método proposto, e que este sistema não parece induzir qualquer efeito citotóxico, tal como demonstram os resultados dos ensaios realizados.------------------------------------------------------------------- ABSTRACT: The immune system has been the target of the most recent advances in cancer treatment. Immunoconjugates, targeted therapies and immunotherapies are the most researched class of products for the treatment of cancer with many drug candidates currently in pre-clinical and late clinical stages of development. Therapies focused on Dendritic cells (DCs) are very promising since DCs are antigen presenting cells and that turns them into interesting targets for controlling the immune response in the presence of cancer cells. Considering that antigens overexpressed by cancer cells could be presented to DCs inducing a protective anticancer immune response, it is important to assess the vehicle with affinity to DCs, as well as finding the right biomaterial to transport the antigens (or fractions of the antigen) to the surrounding environment where DCs can be found and where maturation can be induced. We have hypothesized the development of a nanoparticle system for the delivery and targeting of the drug candidate, mainly an antigen or fractions thereof, which can be formulated using a biodegradable polymer, a non-toxic vehicle that can improve bioavailability of the biologic agent, increasing the targeting capabilities of a pharmaceutical formulation. Hyaluronic acid (HA) was the biopolymer chosen due to its viscoelastic properties, affinity to the surface receptors of DCs such as CD44 and to Toll-like receptors inducing migration and activation of T lymphocytes in the region nodes. The main goal of this thesis was to find an effective method of producing HA nanoparticles through a novel crosslinking method, characterizing the nanoparticles by Nanoparticles Tracking Analysis, measuring particles size, concentration and size distribution. Later, the toxicity of the nanoparticles system was evaluated using Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) upon nanoparticles presentation (by Neubauer chamber and Flow cytometry analysis). Our findings show that it is possible to produce nanoparticles according to the proposed methodology and that the nanoparticulate system does not induce any cytotoxic activity as shown in the assays performed