Diferenciação in vitro de células tronco mesenquimais de placenta humana em fenótipo neural: modelo de co-cultura

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em NeurociênciasAs células tronco (CTs) são células indiferenciadas com habilidade de se auto-renovar infinitivamente, e que em condições apropriadas podem gerar diversos tipos celulares maduros. As células da placenta possuem características morfológicas, imunofenotípicas e funcionais similares as células tronco mesenquimais (CTMs) da medula óssea, porém é improvável que estas células possuam o mesmo potencial de diferenciação e proliferação de CTs embrionárias. Estas células são ainda de origem fetal e podem ser superiores a CTs somáticas em muitos aspectos. Juntamente com o seu fácil acesso, ausência de problemas éticos e abundância celular, as CTMs da placenta podem ser uma alternativa atrativa de progenitores de CTs para pesquisa básica e aplicações clínicas. É importante o estudo do microambiente, pois este e as CTs regulam-se de forma dinâmica e também, torna-se relevante a caracterização das vias de sinalização envolvidas nos processo de diferenciação de CTMs em fenótipo neural, onde são escassos os estudos. Nesta dissertação investigamos o potencial de diferenciação das CTMs de placenta humana, utilizando modelo de co-cultura, para fenótipos neurais. Para alcançarmos nossos objetivos, foram realizadas culturas de CTMs de placenta humana, bem como cultura de células astrocitárias de ratos neonatos. Foram realizados experimentos de co-cultura para verificação da importância do microambiente neural na diferenciação de CTMs, bem como a análise da importância da matriz extracelular (MEC) e dos fatores de crescimento liberados pelas células astrocitárias. Também investigamos as vias de sinalização envolvidas no processo de diferenciação de CTMs para fenótipo neural. As análises dos experimentos se deram por RT-PCR e imunofluorescência, utilizando marcadores de células precursoras neurais, células gliais e neurônios. Nossos resultados demonstram que as CTMs quando em microambiente favorável, têm a potencialidade para se diferenciar em fenótipos neurais, estes resultados são vistos quando as CTMs são co-cultivadas com células astrocitárias de ratos neonatos, bem como quando apenas tratadas com o meio condicionado produzido por estes, demonstrando a importância dos fatores de crescimento liberados pelas células astrocitárias na diferenciação neural de CTMs. Além de apresentarem expressão gênica, estas células possuem a expressão protéica de Nestina, GFAP e B-Tubulina III e também as alterações morfológicas necessárias na diferenciação. Sugerem estar envolvidas na diferenciação para células gliais e precursores neurais as vias MAPK, PI3K e JNK II, porém ambas não afetam a diferenciação para o fenótipo neuronal. The stem cells (SCs) are undifferentiated cells with ability to self-renew, and that under appropriate conditions can generate various cell types ripe. The cells of the placenta have morphological characteristics, and functional immunophenotypes similar mesenchymal stem cells (MSCs) of the bone marrow, but it is unlikely that these cells have the same potential for proliferation and differentiation of embryonic CTs. These cells are of fetal origin and can be greater than somatic SCs in many respects. Along with its easy access, lack of ethical problems in cellular abundance, the MSCs the placenta may be an attractive alternative for parents of SCs for basic research and clinical applications. It is important to the study of the microenvironment as this and the governing SCs are dynamic way and also, it is relevant to the characterization of signalling pathways involved in the process of differentiation of neural MSCs in phenotype, where the studies are scarce. In this dissertation investigated the potential of varying MSCs from human placenta, using model of co-culture, for neural phenotypes. To achieve our goals, cultures were performed for MSCs from human placenta and culture of astrocytes cells of newborn rats. Experiments were conducted in co-culture for verification of the importance of microenvironment in neural differentiation of MSCs, and the analysis of the importance of the extracellular matrix (MEC) and growth factors released by astrocytes cells. We also investigate ways of signalling involved in the process of differentiation of neural MSCs to phenotype. The analysis of the experiments is given by RT-PCR and immunofluorescence using markers of neural precursor cells, gliais cells and neurons. Our results show that the microenvironment favorable MSCs when they have the potential to differentiate into neural phenotypes, these results are seen when the MSCs are co-cultured with cells astrocytes of newborn rats, and only when treated with the means produced by conditioning these, demonstrating the importance of growth factors released by astrocytes cells in neural differentiation of MSCs. Besides submit gene expression, these cells have the protein expression of Nestin, GFAP and B-Tubulin III and the changes needed in morphological differentiation. Suggested to be involved in cell differentiation gliais neural precursors and the MAPK pathways, PI3K and JNK II, but both do not affect the differentiation for the neuronal phenotype