Tipagem molecular de isolados clínicos e ambientais do complexo de espécies de Cryptococcus neoformans através do gene da fosfolipase B (PLB1) e avaliação da susceptibilidade antifúngica

Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada, presente em animais e humanos, que infecta tanto indivíduos imunocomprometidos como imunocompetentes. A criptococose é uma causa significativa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo, sendo a meningoencefalite o sinal mais frequente da doença. Duas espécies estão incluídas no complexo de Cryptococcus neoformans: C. gattii (serotipos B e C) e C. neoformans. Por sua vez, C. neoformans é dividido em duas grandes variedades - var. grubii (serotipo A) e var. neoformans (serotipo D) –, além de incluir estirpes híbridas (serotipo AD). A técnica de RFLP tem sido usada para identificar facilmente os tipos moleculares dos isolados em estudos epidemiológicos. Oito tipos foram descritos: VNI, VNII (ambos correspondentes a estirpes C. neoformans var. grubii), VNIII (estirpes híbridas AD), VNIV (C. neoformans var. neoformans), e VGI-IV (correspondentes a C. gattii). Este trabalho teve como objectivo, caracterizar geneticamente uma colecção de isolados clínicos e ambientais, portugueses e estrangeiros, e avaliar a sua resistência a duas drogas antifúngicas, permitindo comparar os padrões epidemiológicos do complexo de espécies com os encontrados noutras regiões do mundo. A colecção possui 337 isolados de C. neoformans, provenientes de diversos hospitais e regiões, previamente identificados por métodos convencionais de diagnóstico. A determinação dos tipos moleculares foi realizada através do método de RFLP no gene PLB1. Dos 267 isolados analisados, o tipo mais abundante foi VN I (61,42%), seguido por VN III (24,34%). Menos abundantes foram VN IV (10,11%) e VN II (3%), enquanto que VG I foi raro (1,12%). Os restantes tipos moleculares de C. gattii não foram encontrados. Usando o método de difusão em disco, 98 destes isolados foram analisados quanto à susceptibilidade antifúngica. Foi registada resistência ao voriconazol em apenas 3,1% dos isolados testados. Foi encontrada resistência ao fluconazol num elevado número de isolados (32,7%) e susceptibilidade dependendo da dose em 15,3%. Este trabalho, também teve o intuito de correlacionar os resultados anteriores com o tipo molecular. Todavia não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre qualquer dos tipos moleculares e as CMIs correspondentes ao fluconazol. Porém, os resultados mostram que alguns tipos moleculares são menos susceptíveis do que outros em relação ao voriconazol: VN I e VN IV são mais resistentes do que VN II, e VN I e VN II são mais susceptíveis que VN III. Concluindo, a elevada frequência de VN I está de acordo com resultados obtidos em outros estudos em países Europeus e Sul-Americanos. É notável a abundância de VN III em Portugal, tal como relatado noutros países do Sul da Europa, mas também no Chile, contrariamente a outras regiões do globo. A elevada resistência ao fluconazol é compatível com os resultados documentados em estudos anteriores. Esta investigação é um importante passo na epidemiologia da criptococose e da ocorrência de C. neoformans em Portugal.Cryptococcus neoformans is an encapsulated yeast that is present in animals and humans, both in immunocompromised and immunocompetent individuals. Cryptococcosis is a significant cause of morbidity and mortality worldwide, being meningoencephalitis the most frequent sign of disease. Two species are included on the Cryptococcus neoformans complex: C. gattii (serotypes B and C) and C. neoformans. Among C. neoformans, two major varieties exist - var. grubii (serotype A) and var. neoformans (serotype D) -, as well as hybrid strains (serotype AD). Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis has been used to easily identify the molecular types of isolates in epidemiological studies. As such, 8 types have been described: VNI, VNII (both corresponding to C. neoformans var. grubii strains), VNIII (serotype AD hybrid strains), VNIV (C. neoformans var. neoformans), and VGI-IV (all corresponding to C. gattii). The goal of this work was to genetically characterize a collection of clinical and environmental Portuguese and foreign isolates, and to assess their resistance to 2 antifungal drugs, aimed at comparing the epidemiological patterns of the species complex to those found in other regions of the world. The collection possesses 337 C. neoformans isolates obtained from several hospitals and regions, previously identified using conventional mycological diagnosis. The determination of molecular types was performed using the RFLP method on the PLB1 gene. From the 267 isolates analyzed, the VN I type was the most abundant (61.42%), followed by VN III (24.34%). Less abundant were VN IV (10.11%) and VNII (3%), whilst VG I were rare (1.12%). The other molecular types of C. gattii were not found. Using the disk diffusion method, 98 of these isolates were analyzed for antifungal susceptibility. Resistance to voriconazole was found in just 3.1% of the isolates studied. High resistance to fluconazole was registered in an relevant number of isolates (32.7%) and resistance depending on the drug dose in 15.3% other isolates. In this work, it was also aimed to correlate the previous results with the molecular types, although there was not statistically meaningful difference found between any molecular type and the MIC of fluconazole. However the results show that some molecular types are less susceptible than others regarding voriconazole: VN I and VN IV are more resistant than VN II, and VN I and VN II are more susceptible than VN III. In conclusion, the high frequency of VN I agrees with results from other European and South-American countries. It is remarkable the abundance of VN III (hybrid strains) in Portugal, as reported in other Southern European countries, but also in Chile, yet unlike in other regions of the world. Plus, the resistance to fluconazole, in a significant number of isolates is comparable to that found in previously documented studies. This investigation is an important step for the epidemiology of criptococcosis and occurrence of C. neoformans in Portugal