Transglutaminases de Anopheles gambiae: caracterização molecular, bioquímica e histológica.

A malária é causada por parasitas protozoários do género Plasmodium spp, a sua transmissão aos humanos deve-se à picada infecciosa de mosquitos fêmea do género Anopheles spp, sendo Anopheles gambiae o vector mais eficiente de malária em todo o mundo. O intestino médio do mosquito representa um dos ambientes mais desafiantes à sobrevivência e desenvolvimento do parasita, e é, portanto, também um dos locais mais atraentes para novas estratégias de controlo da malária, pois é onde se observa uma diminuição acentuada na população de parasitas invasores. A transglutaminase (TGM) desempenha um papel importante e diversificado em mamíferos, tais como a coagulação e a formação da barreira epitelial, catalisando o “crosslinking” entre proteínas. Em invertebrados, como Drosophila sp, a proteína TGM mostrou estar envolvida na defesa imunitária. O mosquito A. gambiae tem codificado no seu genoma três TGMs, o gene AGAP009099, já caracterizado, é expresso exclusivamente nas MAGs (glândulas auxiliares masculinas). Os genes AGAP009098 e AGAP009100, cujas funções não foram ainda clarificadas, são expressos ubiquamente e em baixos níveis. No presente trabalho, propõe-se a caracterização das duas proteínas codificadas por estes genes, de forma a identificar o modo como estas proteínas interagem dentro do mosquito, a esclarecer o seu papel na invasão do intestino médio de A. gambiae por Plasmodium spp., o que permitirá averiguar o seu envolvimento ao nível da imunidade inata do mosquito. Foi produzida e purificada a proteína recombinante AgTGM98-1, que se utilizou para a produção de um anticorpo anti-AgTGM98. A atividade de TGM no mosquito não se mostrou estatisticamente significativa entre os estadios larvares, pupas e adultos. A caracterização bioquímica de AgTGM98 e AgTGM100 revelou a possível existência de proteínas do tipo TGM. Através de western blotting, verificou-se uma diminuição de AgTGM98, comparando mosquitos não infetados com infetados por P. berghei, o que sugere alterações na expressão desta proteína face à invasão pelo parasita, o que pode significar o seu envolvimento direto na infeção. Caracterizou-se, por imunohistoquímica (IHC) a localização de AgTGM98 e AgTGM100 em intestinos médios de mosquitos. A proteína AgTGM98 apresentou uma localização membranar, na parte basal do intestino médio e com distribuição ao longo deste. Contrariamente, a AgTGM100 tem uma localização intracelular e uma distribuição presente apenas no proventrículo e zona mais apical do intestino médio durante uma fase da sua existência, sendo com o passar do tempo detectada em todo o intestino médio.Malaria is caused by protozoan parasites of the genus Plasmodium spp, its transmission to humans. Malaria is due the bite of infected female mosquitoes of the genus Anopheles spp, being Anopheles gambiae the most efficient vector of malaria worldwide. The mosquito midgut is one of the most challenging environments for the survival and development of the parasite, representing a bottleneck in the parasite development, which makes it one of the most attractive sites for designing new strategies for malaria control. Transglutaminase (TGM) plays an important and diversified role in mammals such as coagulation and formation of the epithelial barrier, catalyzing protein crosslinking. In invertebrates, such as Drosophila sp, TGM protein was shown to be involved on immune defense. The mosquito A. gambiae has encoded on his genome three TGMs, the gene AGAP009099, already characterized, is expressed exclusively in MAG (male auxiliary glands). The genes AGAP009098 and AGAP009100, although still unclear their functions are ubiquitously expressed at low levels. In this work, we propose the characterization of the two proteins coded by these genes, in order to identify how these proteins interact within the mosquito, to help clarifying the invasion of the midgut of A. gambiae by Plasmodium spp., and clarify their role in innate immunity. We had been able to produce and purify a recombinant protein AgTGM98-1, which was used for the production of an anti-AgTGM98 antibody. The activity of mosquito TGMs was not statistically significant between the larval stages, pupae and adults. Biochemical characterization of AgTGM98 and AgTGM100 revealed the possible existence of TGMs-like proteins. By western blotting, it was observed a decrease in the amount of AgTGM98, when comparing non-infected mosquitoes with P. berghei infected mosquitoes, which suggest changes in the expression of this protein, related to parasite invasion, which may indicate its direct involvement in infection. We had also characterized, by immunohistochemistry (IHC) the location of AgTGM98 and AgTGM100 in midguts of mosquitoes. The protein AgTGM98 localizes on the midgut basal membrane with a distribution along this organ. By opposition to AgTGM100, which has an intracellular localization in the proventriculus and apical region, becoming evenly distributed all over the midgut over time