Preparação, caracterização e avaliação da atividade antileucêmica in vitro de nanocápsulas de camptotecina convencionais e furtivas

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em FarmáciaA camptotecina (CPT), um alcalóide proveniente do arbusto Camptotheca acuminata (Descaisne, Nyssaceae), é um fármaco que apresenta elevada atividade antitumoral, cujo mecanismo envolve a inibição da Topoisomerase I, uma enzima altamente expressa nos tumores. Entretanto, a utilização deste fármaco na terapêutica foi limitada, durante anos, em virtude de suas características de baixa solubilidade aquosa, elevada instabilidade em meio fisiológico, e elevada toxicidade. Com o intuito de contornar os inconvenientes da administração deste fármaco e melhorar a sua eficácia terapêutica, estudos da encapsulação da CPT em nanocápsulas poliméricas foram realizados, empregando o poli (D,L-ácido lático) (PLA) e copolímeros em bloco do poli (D,L-ácido lático) e polietilenoglicol (PLA-PEG 49 e 66,6 kD). Estes últimos foram empregados com o intuito de obter nanopartículas furtivas, ou seja, que escapam do reconhecimento e captura pelos macrófagos. As suspensões de nanocápsulas foram preparadas pela técnica de deposição interfacial do polímero pré-formado (nanoprecipitação) e caracterizadas quanto ao diâmetro médio das partículas e potencial zeta. A viabilidade da preparação das nanocápsulas em diferentes condições foi avaliada. A eficiência de encapsulação e o teor de fármaco foram determinados por meio de uma metodologia analítica de cromatografia liquida de alta eficiência previamente validada. Um delineamento estatístico fatorial foi aplicado para determinar a influência de duas variáveis independentes (tipo de óleo e tipo do polímero) sobre o teor de camptotecina nas suspensões coloidais. Suspensões coloidais monodispersas, apresentando partículas com diâmetro médio entre 140 e 200 nm e potencial zeta entre -25 e -42 mV, foram obtidas pela técnica de nanoprecipitação. Elevados valores de eficiência de encapsulação foram obtidos em todas formulações testadas. Ambos, tipo de polímero e tipo de óleo afetaram significativamente o teor de fármaco das formulações. Ensaios de liberação foram realizados empregando a técnica de difusão através de membrana e tampão fosfato pH 7,4 contendo Tween 2% como meio de liberação. A concentração de CPT no meio de liberação foi determinada por uma metodologia de espectrofluorimetria. Após 96 horas de ensaio, cerca de 40 a 60% do fármaco foi liberado, dependendo da formulação testada. Estudos de citotoxicidade in vitro da CPT livre e encapsulada foram conduzidos usando linhagens de células de leucemia linfoblástica aguda murina L1210 e de leucemia mielomonocítica murina WEHI-3B. Na concentração de 0,1 µg/mL, tanto a CPT livre como encapsulada reduziram significativamente o número de células leucêmicas L1210 viáveis(P<0,005 versus grupo controle), mas não foi observada diferença significativa quando o grupo tratado com as nanocápsulas foi comparado com o tratado com o fármaco livre. Na mesma concentração, quando as células leucêmicas WeHi-3B foram testadas, somente as nanocápsulas de PLA contendo CPT reduziram significativamente o número de células viáveis (P<0,005). Estudos in vivo necessitam ainda ser conduzidos para demonstrar o interesse da utilização de nanocápsulas no tratamento das leucemias. Camptothecin (CPT), an alkaloid obtained from Camptotheca acuminata (Descaine, Nyssaceae), is a drug that displays high antitumor activity, and its mechanism entails the inhibition of the Topoisomerase I, an enzyme highly expressed in the tumors. Neverthless, camptothecin's use in therapeutics has been limited by its low water solubility, low stability in physiological medium, and high toxicity. In order to overcome these drug drawbacks and to improve the therapeutic efficacy, encapsulation studies of CPT in nanocapsules was done using poly (D,L-lactide) (PLA) and poly (D,L lactide)-poly(ethyleneglycol) diblock copolymers (PLA-PEG 49 e 66.6 kD). These polymers were used in order to obtain stealth nanocapsules, which are able to escape from macrophage uptake. The nanocapsule suspensions were prepared by interfacial deposition of preformed polymer (nanoprecipitation) and were physicochemically characterized. The feasibility of the nanocapsule preparation using diferent conditions was evaluated. The encapsulation efficiency and CPT content in the nanocapsules were estimated by a validated high performance liquid cromatography method. A factorial design was employed to investigate the effect of two independent variables (oil and polymer type) on CPT content. The nanoparticles dysplayed mean diameter varying from 140 to 200 nm and zeta potencial from -25 to -40 mV. The encapsulation efficiency values were high for all tested formulations. Both type of the polymer and oil affected significantly the CPT content in the nanocapsule suspensions. In vitro release studies were done using the membrane difusion method and phosphate buffer solution pH 7.4, containing 2% Tween 80, as releasing medium. The release of CPT varied from 40 to 60% after 96 hours. The cytotoxicity of the free drug and CPT-loaded nanocapsule suspensios was evaluated by MTT method against a mouse lymphocytic leukemia cell line (L1210) and a myelomonocytic leukemia cell line (WeHi-3B). The free drug and CPT-loaded nanocapsules caused significant L1210 cell death in the concentration of 0.1 µg/mL (P<0.005 versus control group). However, statistical significant difference was not observed when cells were treated with the CPT-loaded nanocapsules or free drug. On the other hand, only CPT-loaded PLA nanocapsules reduced significantly the number of WeHi 3B viable cells (P