Ocorrência e diversidade de leveduras no filoplano de plantas seleccionadas do Parque Natural da Serra da Arrábida

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Biologia (especialidade Microbiologia), pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e TecnologiaOs ecossistemas do tipo mediterrânico não têm sido investigados como habitat natural de populações microbianas em geral, e de leveduras em particular. Um dos objectivos deste estudo foi o de apreciar a abundância, diversidade e variação sazonal das leveduras epifíticas no filoplano de plantas representativas de um ecossistema do tipo mediterrânico em Portugal, neste caso o Parque Natural da Arrábida. Foram seleccionados dois locais de amostragem na Serra da Arrábida, Fonte do Veado (FV), com um microclima mais húmido, e Mata do Solitário (MS), mais seco e árido, e cinco plantas: Acer monspessulanum e Quercus faginea (folha caduca), e Cistus albidus, Pistacia lentiscus e Osyris quadripartita (folha perene). O isolamento de leveduras foi baseado em dois métodos complementares: plaqueamento de suspensões resultantes das lavagens das folhas e o método SFM (Spore-Fall Method), mais específico para leveduras balistoconidiogénicas. Cerca de 90% das leveduras isoladas do filoplano (de um total de cerca de 850 estirpes) são de afinidade basidiomiceta, representando pelo menos 67 espécies. Destas, cerca de metade não parecem corresponder a espécies conhecidas e aproximadamente 75% do número total de espécies foram isoladas apenas uma vez ou ocorreram com baixa frequência. Entre as poucas leveduras ascomicetas isoladas, a grande maioria parecem tratar-se de possíveis estados leveduriformes do fungo fitopatogénico dimórfico Taphrina (grupo dos fungos arquiascomicetas). Aproximadamente 15% das espécies foram isoladas a partir da maioria das amostras, independentemente da planta, local e data de amostragem, como por exemplo Cryptococcus cf. laurentii, Erythrobasidium cf. hasegawianum, Rhodotorula cf. slooffiae, Sporobolomyces cf. roseus, Rh. bacarum, Tilletiopsis spp. e Lalaria inositophila sp. nov.. Também isoladas de várias folhas, mas com uma distribuição aparentemente menos ampla, aparecem espécies como Sp. coprosmae e Sp. gracilis. Foram registados casos de distribuição restrita de algumas espécies, em contraste com a aparente inespecificidade das leveduras do filoplano relativamente às plantas colonizadas. O mais saliente foi o de Cryptococcus sp. nov. 1 que foi isolada com uma frequência relativamente elevada apenas a partir de folhas de Ci. albidus, tanto na FV como na MS, e em várias amostragens. Para as espécies de plantas presentes em ambos os locais de amostragem (Q. faginea, Ci. albidus e Pi. lentiscus) observou-se que, de um modo geral, as populações de leveduras nos respectivos filoplanos são maiores na FV do que na MS. Esta diferença não parece reflectir-se, porém, na diversidade em termos do número de espécies isoladas. Foi detectado um aumento, da Primavera para o Outono, do número de leveduras presentes nas folhas das plantas de folha caduca Ac. monspessulanum e Q. faginea, acompanhando o seu desenvolvimento. Esta variação sazonal não foi aparente nas plantas de folha perene. Nas folhas de Pi. lentiscus e O. quadripartita as leveduras ocorreram, consistentemente, em menor número. Foram encontradas densidades muito variáveis para a população de leveduras nos diferentes filoplanos amostrados, desde 10 UFC.cm-2, obtida em Pi. lentiscus e O. quadripartita, até valores da ordem de 104 UFC.cm-2, obtidos numa das amostragens de Q. faginea. É concebível que as leveduras do filoplano tenham propriedades que lhes permitem sobreviver e multiplicar-se no ambiente em que se encontram. Nesse sentido, realizou-se uma pesquisa de natureza preliminar num grupo seleccionado das leveduras isoladas do filoplano: (i) capacidade de utilização de compostos aromáticos, ácidos aldáricos e aminoácidos como fontes de carbono e de energia; (ii) produção de certas enzimas extracelulares; (iii) produção de pigmentos do tipo melanina, e (iv) actividade antimicrobiana. Foi particularmente notória a produção de enzimas extracelulares por Cryptococcus spp. (Filobasidiales), Tilletiopsis spp. (classe Ustilaginomicetas) e Sp. cf. roseus (Sporidiobolus). Uma grande parte das estirpes testadas demonstrou ainda capacidade para utilizar, como fontes de carbono e de energia, vários compostos que ocorrem em plantas, nomeadamente aminoácidos como o ácido glutâmico e a prolina, açúcares (p.e. celobiose e L-arabinose) e compostos aromáticos (p.e. ácidos protocatecuico e p-hidroxibenzóico). Cerca de 65% das estirpes produziram culturas melanizadas a partir de pelo menos um dos compostos precursores utilizados, com realce para as leveduras representantes do grupo das Filobasidiales e algumas da classe Ustilaginomicetas. Não se detectou uma produção significativa de compostos antimicrobianos por qualquer das leveduras testadas. Este trabalho também visou o desenvolvimento de um método molecular, baseado na hibridação in situ com sondas de DNA marcadas com fluorocromos (FISH), para a detecção e identificação das leveduras directamente nos seus meios naturais, evitanto recorrer à sua cultura e isolamento. Foram, primeiro, optimizados os procedimentos para o desenho das sondas, através da construção de ferramentas informáticas para a recolha e comparação de sequências de DNA e testes de especificidade in silico, e determinados os locais do rRNA 18S e da região D1/D2 do rRNA 26S mais acessíveis para a hibridação. O método foi, então, aplicado para re-avaliar a aparente associação observada entre Cryptococcus sp. nov. 1 e as folhas de Ci. albidus. Com uma sonda específica que se desenhou para esta espécie de levedura, foram detectadas células de Cryptococcus sp. nov. 1 em suspensões celulares resultantes da lavagem de folhas de Ci. albidus, mas não quando se utilizaram folhas das outras plantas estudadas. Em consequência deste estudo, observou-se que a densidade de Cryptococcus sp. nov. 1 em folhas individuais de Ci. albidus não parece seguir uma distribuição normal, apresentando um comportamento semelhante ao evidenciado para as densidades das populações bacterianas, para as quais é o logaritmo das densidades que está distribuído normalmente. As folhas apresentaram densidades até 370 células de Cryptococcus sp. nov. 1 por cm2, mas a grande maioria exibia densidades inferiores a 40 células/cm2.Bolsa de doutoramento PRAXIS XXI/BD/19833/99, financiada pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia