Purificação e caracterização da glutationa S-transferase (E.C.2.5.1.18) de brânquias de ostras Crassostrea rhizoporae (Guilding, 1828)

Dissertação (mestrado) - Univesidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.A ostra Crassostrea rhizophorae vem sendo amplamente utilizada como um organismo sentinela em programas de biomonitoramento marinho. Biomarcadores de contaminação são ferramentas importantes para a avaliação dos efeitos provocados por contaminantes em organismos expostos. No entanto, são necessários estudos que visem uma melhor compreensão, caracterização e padronização do uso destas respostas bioquímico-moleculares para que as mesmas possam ser utilizadas em estudos Ecotoxicológicos. A família das GST é comumente utilizada como biomarcador de exposição a xenobióticos. Estas enzimas desempenham importante papel nos processos de detoxificação celular, catalisando algumas das principais reações de conjugação da Fase II de biotransformação. O objetivo do presente estudo foi purificar e caracterizar GSTs de brânquias de ostras do mangue C. rhizophorae. Extratos de brânquias foram submetidos à cromatografia de afinidade em coluna GSH-agarose. A atividade da GST das frações eluídas foi testada utilizando-se os substratos 1-cloro, 2,4-dinitrobenzeno (GST-CDNB) e ácido etacrínico (GST-ETA). As frações que apresentaram atividade foram analisadas através de eletroforese bidimensional e ensaios cinéticos utilizando os substratos CDNB e GSH. A atividade da GST no pico de eluição da coluna de afinidade foi 14,1 e 7,5 U/ mg de proteína para os substratos CDNB e ETA, respectivamente. A massa molecular aparente foi de 26,09 kDa, sendo que foram observados seis spots de pI diferentes (pI 7,6-5,4), sugerindo a presença de diferentes sub-unidades. Os valores de Km determinados foram Km CDNB = 1,37 mM e Km GSH = 0,77 mM. Os resultados obtidos foram similares aos observados previamente em estudos com GSTs de diferentes espécies de organismos aquáticos. A elevada atividade da GST-ETA sugere a presença de isoformas da classe Pi, e que esta é, possivelmente, a mais representativa isoforma de GST em brânquias de ostras C. rhizophorae. No entanto, estudos subseqüentes deverão ser realizados visando identificar outras isoformas de GST presentes nesta espécie. Mangrove oyster Crassostrea rhizophorae has been extensively used as a sentinel organism in marine monitoring programs. Biomarkers of contamination are important tools to understand the effects elicited by contaminants in exposed organisms. However, studies aiming the understanding, characterization and standardization of these biochemical-molecular responses in ecotoxicological studies are still required. The GST family is commonly used as biomarkers of exposure to xenobiotics. These enzymes play an important role in cell detoxification, catalyzing one of the major Phase II biotransformation reactions. The aim of this study was to purify and to characterize the GSTs from gills of C. rhizophorae. Gill extracts were submitted to affinity chromatography using GSH-agarose column. The GST activity was analyzed in the eluted fractions using 1-chlorine,2,4-dinitrobenzene (GST-CDNB) and ethachrinic acid (GST-ETA). The fractions containing the peaks of GST activity were submitted to 2D electrophoresis and kinetics analysis, using CDNB and GSH. The activity detected in the elution peaks was 14,1 and 7,5 U/ mg protein for CDNB and ETA, respectively. The apparent molecular mass was 26,09 kDa and six spots with pI values ranged from 7,6 to 5,4 were observed, suggesting the presence of different GST subunits. The Km values were Km CDNB = 1,37 mM and Km GSH = 0,77 mM. These findings are in agreement with those observed for GSTs in similar studies carried out in different species of aquatic organisms. The elevated GST-ETA suggests the presence of GST Pi class isoform and that is, possibly, the most abundant GST isoform in the gills of C. rhizohorae. Moreover, subsequent studies need to be carried out to identify other GST isoforms in this specie