Caracterização e avaliação de metalotioneíma como biomarcador de exposição a cádmio no mexilhão Perna perna (Linné, 1758)

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.Metalotioneínas (MT) são proteínas de baixo peso molecular, termoresistentes e ricas em resíduos de cisteína. Devido a sua afinidade por metais-traço, tem sido sugerido que, em organismos aquáticos, estas proteínas atuem na homeostase e detoxificação de metais essenciais (Cu e Zn) e não essenciais (Cd e Hg). Além disso, as MT poderiam estar envolvidas na resistência a metais em organismos expostos a estes compostos. O objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar a presença de MT na glândula digestiva do mexilhão Perna perna, clonar e seqüenciar o cDNA de MT a partir das brânquias e padronizar as técnicas de PCR semi-quantitativa e Slot blotting para detectar os níveis de MT em animais expostos a cádmio em laboratório. Dois grupos de mexilhões (n=3 por grupo) foram expostos a Cd (0,3 mg/L) por 7 e 15 dias. As glândulas digestivas foram retiradas, homogeneizadas e centrifugadas. Os sobrenadantes resultantes foram submetidos à cromatografia de filtração em gel (Sephadex G-75). Uma fração correspondente a proteínas de baixo peso molecular (faixa de PM = 20 -10 kDa) foi observada nos animais expostos a cádmio. Estes resultados estão de acordo com o perfil de eluição das amostras, obtido por cromatografia líquida de alta performance (HPLC), em uma coluna de exclusão molecular (DIOL - 150; Shimadzu). A presença de Cd foi determinada nesta fração de baixo peso molecular, através de análises químicas por ICP - MS. Alíquotas do sobrenadante e das frações obtidas foram analisadas através de eletroforese em um gel gradiente de poliacrilamida, em condições desnaturantes (PAGE-SDS) e, uma proteína com peso molecular aparente de 16 kDa foi detectada. Mexilhões foram expostos a Cd (0,25 e 0,5 mg/L) por 48 horas, 7 e 18 dias (n=5 por grupo). As brânquias foram retiradas e utilizadas para a extração de RNA total. A partir do cDNA obtido foi realizada a reação de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), utilizando diferentes iniciadores para a amplificação de sequências de MT e de b-actina. O fragmento correspondente à MT foi clonado e aguarda sequenciamento. Além disso, as técnicas de PCR semi-quantitativa e Slot blotting foram avaliadas como ferramentas para a quantificação dos níveis de MT nos mexilhões expostos a Cd. De acordo com os resultados preliminares obtidos, ambas as metodologias mostraram-se eficientes. O aumento nos níveis de proteínas ligantes a metais e do RNA da MT pode ser atribuído a uma resposta de defesa celular contra a exposição a metais. Sua avaliação, através de metodologias como HPLC, PCR semi-quantitativa e Slot blotting, representa uma perspectiva relevante para o biomonitoramento ambiental, utilizando o mexilhão Perna perna