Caracterização parcial do extrato bruto produzido por Bacillus amyloliquefaciens e ensaios preliminares de citotoxicidade

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos.Levando-se em consideração os grandes índices de morbidade causados pela contaminação de alimentos, fica evidente a necessidade de desenvolver novas alternativas de conservação para disponibilizar para a população alimentos de qualidade cada vez melhor e mais seguros, do ponto de vista microbiológico e toxicológico. Frente a essa realidade, esse estudo teve como objetivo otimizar a técnica de extração da substância antimicrobiana e sua caracterização bem como realizar uma avaliação preliminar da citotoxicidade do extrato bruto produzido por Bacillus amyloliquefaciens. O extrato bruto foi obtido de uma cultura de Bacillus amyloliquefaciens em caldo triptona de soja suplementado com extrato de levedura, incubado a 35oC por 24 h, precipitado com sulfato de amônio, ressuspendido em tampão fosfato 0,2 M pH 7,2, dialisado em membrana de 3,5 kDa e esterilizado por filtração em membrana de 0,22 mm. O mesmo procedimento foi repetido substituindo o tampão fosfato por água destilada. Todos os ensaios desse estudo foram realizados com dois pools de extrato bruto, sendo um obtido pela mistura de extratos brutos extraídos em tampão e o outro obtido pela mistura de extratos brutos extraídos em água. O extrato bruto foi submetido aos seguintes ensaios de caracterização: atividade antimicrobiana em ágar triptona de soja suplementado com extrato de levedura e em ágar sangue, perfil de proteínas em gel de poliacrilamida e aminograma. Como microrganismo indicador foi utilizado Listeria monocytogenes a 105 UFC/mL. Foram realizados ensaios preliminares de citotoxicidade como atividade hemolítica em tubos e em placas de ágar sangue e citotoxicidade em células VERO. Nos ensaios de atividade antimicrobiana em ágar triptona de soja suplementado com extrato de levedura o extrato bruto apresentou um halo de inibição máximo de 8,3 mm (profundidade) e 7,5 mm (superfície) numa concentração de 80 mg e 10 mg de proteína, respectivamente; em ágar sangue observou-se um halo de inibição máximo de 4,5 mm (profundidade) e 6,6 mm (superfície) numa concentração de 80 mg e 10 mg de proteína, respectivamente. Para determinação da composição global de aminoácidos em eletroforese PAGE (7,5 a 20%)/SDS (10%) foram constatadas seis bandas com pesos moleculares aparentes de: 14,8; 20; 29; 30; 34 e 56,2 kDa e composto principalmente de aminoácidos hidrofóbicos (não polares), incluindo a prolina (446,77 ppm), leucina (11,03 ppm), valina (6,27 ppm), isoleucina (4,59 ppm), alanina (2,91 ppm) e glicina (1,87 ppm). A quantidade de aminoácidos totais presentes no extrato bruto foi de 526,59 ppm. Em ensaios de citotoxicidade, o extrato bruto apresentou uma concentração hemolítica 50% em tubos na concentração de 11,43 mg de proteína numa suspensão de eritrócitos de carneiro e uma concentração citotóxica 50% na concentração de 32,14 mg de proteína em células VERO; o halo de hemólise máximo em placas de ágar sangue foi de 5,6 mm (profundidade) e 5,7 mm (superfície) numa concentração de 80 mg e 10 mg de proteína, respectivamente. Os resultados obtidos sugerem que o extrato bruto produzido por Bacillus amyloliquefaciens é composto principalmente de proteases e outras enzimas bacteriolíticas