Adaptação e otimização de protocolos para a extração de DNA e para marcadores moleculares em Araucaria angustifolia

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.O presente trabalho apresenta os resultados referentes à otimização de um protocolo para a extração de DNA a partir de acículas de plantas adultas de Araucaria angustifolia e critérios para o armazenamento e conservação do material vegetal, além da otimização e adaptação de protocolos para as técnicas RAPD e AFLP, bem como o teste de transferibilidade de iniciadores para marcadores microssatélites de Pinus sp para A. angustifolia. A capacidade informativa destes marcadores para análise da diversidade genética de A. angustifolia foi testada em uma população natural do Parque Ecológico Municipal de Lages/SC, a qual já havia sido estudada com marcadores isoenzimáticos e RFLP-PCR. Observou-se que o acondicionamento e armazenamento das acículas é um fator crucial para a qualidade do DNA extraído. A quantidade de DNA obtido nas extrações variou entre 66 a 400 mg por grama de tecido, com um valor médio de 147,3 mg para os materiais acondicionados em sílica gel. Materiais acondicionados em caixas térmicas com gelo resultaram em DNA com qualidade inferior, com uma média de 137,3 mg. Materiais armazenados por até três meses a -20°C resultaram em menor quantidade de DNA, com qualidade inferior. O protocolo otimizado resultou em DNA com baixa contaminação por proteínas, com razão OD260/OD280 entre 1,7 e 2,0 em 80% das amostras analisadas. Com o protocolo otimizado para a técnica RAPD, 10% dos iniciadores utilizados revelaram polimorfismo quando testados em indivíduos de duas populações, todavia, apenas 7,5% revelaram polimorfismo quando somente a população de Lages foi analisada. Os seis iniciadores utilizados revelaram 18 bandas polimórficas. O protocolo adaptado para a técnica AFLP possibilitou um número variável de bandas polimórficas, entre nenhuma e 29 bandas, dependendo da combinação de iniciadores utilizada. Dentre 29 iniciadores para marcadores microssatélites testados, somente dois geraram produtos amplificados em A. angustifolia, sem, no entanto serem utilizados para a análise da diversidade genética da população, devido à característica das bandas. A análise da diversidade genética da população foi realizada a partir de 18 marcadores RAPD, 62 marcadores AFLP e com os 80 marcadores agrupados. A diversidade genética estimada pelo índice de Shannon foi de 0,53, 0,54 e 0,54, respectivamente. Os dendogramas de similaridade genética gerados também apresentaram grande coerência entre as três situações testadas. O nível de diversidade genética estimado com esses marcadores foi superior àquele obtido com marcadores isoenzimáticos e RFLP-PCR utilizados anteriormente por outros pesquisadores. Os resultados obtidos neste trabalho levam à conclusão que o armazenamento das folhas e o processo de extração do DNA são cruciais para o sucesso de estudos utilizando marcadores baseados na análise direta do DNA e confirmam a hipótese de que marcadores RAPD e AFLP são poderosas ferramentas para estudos genéticos em A. angustifolia, devido à sua capacidade de acessar aleatoriamente, amplas regiões genômicas. Já o baixo nível de transferibilidade de iniciadores microssatélites deve-se, provavelmente, à grande distância taxonômica entre as espécies utilizadas no estudo, caracterizando a necessidade do desenvolvimento de iniciadores para regiões microssatélites específicos para A. angustifolia