Microscopy of Time Variable Biologic Objects

Předmětem disertační práce je využití transmisního digitálního holografického mikroskopu (DHM) navrženého a zkonstruovaného v Laboratoři optické mikroskopie na ÚFI VUT v Brně pro výzkum dynamiky živých buněk. První část práce se zabývá teoretickým popisem vlastností zobrazení mikroskopu v závislosti na koherenci osvětlení doplněným experimenty s modelovým a reálným biologickým vzorkem. V další části jsou popsány konstrukční změny a inovace mikroskopu a jeho vybavení, které umožnily využívání mikroskopu pro pozorování živých buněk. V~experimentální části byla vypracována metodika přípravy a pozorování živých buněk pro DHM, která byla ověřena při zobrazení dynamiky buněčné apoptózy indukované cytostatikem cis-platinou. Byla zkoumána také dynamika živých buněk při standardních podmínkách a za působení deprivačního stimulu. Pro vyhodnocení kvantitativních změn rozmístění buněčné hmoty během experimentů byla vytvořena metoda zpracování holograficky rekonstruované fáze nazvaná "dynamické fázové diference". Touto metodou byly odhaleny různé vzorce chování rakovinových buněk během specifické reakce v závislosti na typu buněk, stupni jejich malignity a hustotě porostu. Pro kvantitativní analýzu fázového zobrazení z DHM byla navržena vhodná statistická charakteristika a způsob interpretace naměřených dat, které byly úspěšně aplikovány při porovnání vnitrobuněčného pohybu dvou typů rakovinových buněk rodičovské a dceřiné linie. Na základě uvedeného zpracování pozorování byly stanoveny hypotézy o mechanismu reakce nádorových buněk na nepříznivé životní podmínky.The subject of the PhD thesis is the application of a transmission digital holographic microscope (DHM) which was designed and constructed in the Laboratory of optical microscopy at the IPE BUT for the research of live cells dynamics. First part of the work is concerned with theoretical description of the microscope imaging properties dependent on the coherence of illumination. It is supplemented with experiments of imaging of a model and a real biological specimen. The following part describes construction modifications and innovations of the microscope and its equipment that enabled the utilization of the microscope for live cells observations. In the experimental part the methodology of live cells preparation and DHM imaging was worked out. The methodology was verified by the observation of cell dynamics during an apoptosis induced by the cytostaticum cis-platinum. Further experiments examined the dynamics of live cells in standard conditions and during a deprivation stimulus. A novel method of holographically reconstructed phase, named \uva{dynamic phase differences}, was set up to evaluate quantitative changes of cell mass distribution during the experiments. Depending on the degree of malignancy and density of cell outgrowth, various schemes of cancer cells behaviour during a specific reaction were revealed using this method. For the quantitative analysis of the DHM phase imaging, a suitable statistical characteristic and an interpretation of the measured data were proposed. Both of them were successfully applied for the comparison of cell motility of two cell types: parental and progeny cell lines. On the basis of the proposed processing, hypotheses describing the reaction mechanism of tumour cells to stress life conditions were established. In the conclusions we summarize our findings and suggestions for the construction and the applications of a new generation of the transmission DHM.