Flow-chambers for microscopy of living cells

Byla navržena a zkonstruována průtoková komůrka pro dlouhodobé pozorování živých buněk v transmisním, koherencí řízeném holografickém mikroskopu (CCHM), který byl vyvinut v Laboratoři experimentální biofotoniky na Ústavu fyzikálního inženýrství VUT v Brně. CCHM umožňuje vyhodnocovat dynamické změny uvnitř živé buňky díky kvantitativní informaci o fázovém posuvu pro každý obrazový bod. Aby se experimentálně prokázaly výhody CCHM, je důležité dlouhodobě udržovat optimální kultivační podmínky přidáváním čerstvého kultivačního média pro pozorované buňky přímo v mikroskopu. Průtoková komůrka umožňuje jak výměnu kultivačního média, tak aplikaci biologických činidel bez nutnosti vyjmutí komůrky z mikroskopu, jak je tomu u stacionárních komůrek. Můžeme tak sledovat životní projevy před aplikací činidel a reakci buněk po aplikaci. Na základě publikací s řešenými návrhy průtokových komůrek, uvedených v předložené diplomové práci, byl realizován originální průtokový systém s příslušenstvím, vyhovující konstrukčnímu řešení CCHM. Byly rovněž diskutovány vlastnosti proudění a proces výměny kapalin v průtokové komůrce a na základě provedených simulací byl modifikován tvar vnitřního prostoru komůrky. Funkčnost a použitelnost průtokové komůrky byla experimentálně prokázána v CCHM i v jiných mikroskopech. V navržených průtokových komůrkách byly úspěšně pozorovány reakce nádorových a epiteliálních buněk na změnu prostředí z kultivačního média na fyziologický roztok.The perfusion chamber for long term observing of live cells by the means the Coherence-Controlled Holographic Microscope (CCHM) was designed. CCHM was built and designed at the Laboratory of the optical microscopy at the Institute of Physical Engineering, Brno University of Technology. CCHM can quantitatively evaluate dynamical changes inside live cells thanks to the quantitative information about phase shift in each pixel of the image. In order to demonstrate advantages of CCHM experimentally, it is important to keep the live cells in the good conditions. This is made by adding the fresh cultivation medium for studied cells directly in the microscope. In contrast to the stationary chamber the perfusion chamber allows both the cultivation medium exchange and the application of biological reagents without the necessity of removing the chamber from the microscope. Therefore we can study the vital signs of cells before and after the application of reagents. An original perfusion system with accessories compatible with CCHM was designed. The design is based on the previously published perfusion system solutions that are referred to in this thesis. The flow characteristics and medium exchange process was discussed and a modification of the internal geometry, based on numerical simulations, was introduced. The applicability of this perfusion chamber has been proven for the CCHM and even for different types of microscopes. The reactions of tumor and epithelial cells during the change of the environment from the cultivation medium to the physiologically solution were studied.