Random mutagenesis and selection of red yeast mutants capable to utilize particular waste substrates

Karotenoidy sú prirodzene sa vyskytujúce farbivá rastlinných pletív, ktoré sú produkované aj mikroorganizmami. Nachádzajú svoje uplatnenie predovšetkým v potravinárskom priemysle, ale taktiež aj v chemickom, farmaceutickom či kozmetickom priemysle. V súčasnosti je izolácia karotenoidov z rastlinných materiálov výrazne regulovaná legislatívou, preto sa kladie dôraz na štúdium ich produkcie pomocou mikroorganizmov. Zároveň sa táto výroba uprednostňuje pred výrobou syntetických karotenoidov. Táto diplomová práca bola poňatá ako porovnávacia štúdia karotenogénnych kvasiniek patriacich do rodov Rhodotorula, Sporobolomyces a Cystofilobasidium, u ktorých bola zisťovaná schopnosť využitia rôznych odpadových substrátov ako zdrojov uhlíka, dusíka a ostatných nutričných faktorov pre produkciu karotenoidov. V práci boli optimalizované podmienky náhodnej mutácie kvasiniek. Na vybrané kmene boli aplikované rôzne koncentrácie chemického mutagénu ethylesteru kyseliny methánsulfónovej (EMS) za účelom zvýšenia produkcie karotenoidov a sledovaných lipidických látok. Mutagenéza a selekcia mutantných kmeňov bola prevedená na odpadových substrátoch ako je glycerol, vaječné cestoviny a vaječné cestoviny hydrolyzované pomocou extracelulárnych enzýmov z vybraných plesní. U vybraných mutantných kvasinkových kmeňov, ktoré vykazovali nadprodukčné schopnosti, bola prevedená kontrola špecifických častí DNA metódou DGGE – denaturačnej gradientovej gélovej elektroforézy. DNA mutantných kmeňov bola porovnávaná s DNA kmeňov nemutovaných. Zvýšená produkcia - karoténu bola dosiahnutá u mutantného kmeňa Sporobolomyces roseus (až 1,55 mg/g sušiny), a to v prípade použitia glycerolového, cestovinového i hydrolyzovaného cestovinového média. U mutantných kvasiniek rodu Rhodotorula bola charakteristická nadprodukcia karotenoidov najčastejšie iba v prípade použitia klasického glukózového média. Mutanty kvasinky Cystofilobasidium capitatum nevykazovali nárast biomasy, no na druhej strane došlo počas ich kultivácie k miernemu zvýšeniu produkcie karotenoidov, najmä pri použití cestovinového média hydrolyzovaného enzýmovým preparátom pripraveným z plesne Fusarium solani. V práci bolo potvrdené, že pomocou náhodnej mutagenézy je možné vyselektovať kmene schopné využívať s výhodou odpadné substráty, najmä hydrolyzované cestovinové odpady. U mutantných kmeňov bola pozorovaná zvýšená produkcia karotenidov, čo umožňuje efektívne využitie lacnejšieho substrátu a súčasne zníženie negatívneho vplyvu odpadov na životné prostredie.Carotenoids are naturally occurring pigments of plants also produced by microbes. The area of their application concerns mainly food industry; however, they are used in chemical, pharmaceutical, and cosmetics industry as well. Currently, the isolation of carotenoids from plants is markedly regulated by legislation, so the study of their production is greatly emphasised, where the microbiological, instead of the synthetic, production of carotenoids is being prioritized. This work was made as a comparative study of carotenogenic yeasts of the genes Rhodotorula, Sporobolomyces, and Cystofilobasidium. Their ability to use various waste substrates as a carbon and nitrogen source and source of other nutrition factors was tested. In this work, conditions of random mutagenesis were optimized. Particular yeast strains were also subjected to the effect of mutagen ethyl methanesulfonate (EMS) in order to increase the production of biomass and specific metabolites – carotenoids and other lipid-soluble substances. Random mutagenesis and mutant strain selection was performed using waste subtrates as glycerol, pasta and some pasta hydrolyzed by fungal extracellular enzymes. Subsequently, a control of specific DNA sequences in pigments overproducing mutants was analyzed by PCR/DGGE (denaturating gradient gel electrophoresis). Increased production of -carotene was achieved in a mutant of Sporobolomyces roseus strain growing on glycerol, pasta, and hydrolyzed pasta. Overproduction of carotenoids by mutant strain of Rhodotorula glutinis was observed in glucose medium only. Mutants of Cystofilobasidium capitatum exhibited a decrease of biomass production; on the other hand, the production of carotenoids increased especially in pasta medium hydrolyzed by enzyme preparative from Fusarium solani. In this work it was confirmed that using random mutagenesis strains capable to utilize waste substrates can be selected. In mutant strains increased carotenoids biosynthesis was observed, which enables effective use of cheap substrates and reduction of the negative effects of wastes on the environment.