Compuestos con actividad antifúngica: estrategias para la erradicación del biofilm.

Tesina (Grado en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Cátedra de Microbiología, Departamento de Fisiología. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal-IMBIV- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnica-CONICET- Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Universidad Nacional de Córdoba. 2019 - 79 h.; grafs.; tabls.; figuras. Contiene Referencia Bibliográfica.Las infecciones fúngicas invasivas son causadas predominantemente por el género Candida, siendo algunas especies patógenas oportunistas en humanos. Candida posee capacidad de adherirse a superficies tanto bióticas como abióticas y formar biofilm. Las células sésiles del biofilm pueden ser hasta 1000 veces más resistentes a los fármacos antimicrobianos que las células planctónicas. La resistencia que presenta el biofilm hace que se requieran dosis muy altas de fármacos en el tratamiento de infecciones fúngicas. Anfotericina B (AmB) es un antifúngico (ATF) de referencia, sin embargo, presenta alta nefrotoxicidad, entre otros efectos secundarios. El compuesto natural ácido úsnico (AU)es un metabolito secundario presente en líquenes que posee actividad antimicrobiana en células planctónicas o de vida libre. Una estrategia contra patógenos resistentes, podría ser la combinación de fármacos utilizados en la clínica con compuestos de origen natural que permitan mejorar la actividad contra el biofilm. Por otro lado, se están estudiando nanopartículas (NP) con propiedades contra micro organismos patógenos.Las NP obtenidas por síntesis biológica tienen especial interés por ser amigables con el ambiente. Una estrategia emergente es combinar NP, como las de plata (NP Ag), en busca de sinergia y así potenciar la actividad antimicrobiana. El objetivo de esta tesina fue realizar estudios con el principio activo natural AU y con NP Ag biosintetizadas que exhiban un perfil antifúngico frente al biofilm maduro de Candida albicans y Candida no albicans, combinados con un ATF de referencia como AmB para erradicar este factor de virulencia microbiano. Se utilizaron las cepas de C. albicans SC5314 y de Candida tropicalis NCPF 3111, ambas cepas de colección. Se evaluó el efecto del AU, extraído de Usnea amblyoclada, de NP Ag biosintetizadas a partir de Penicillium expansum y de AmB. Se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM) del AU, de las NP Ag biosintetizadas y de AmB en células planctónicas de ambos géneros fúngicos. Se formaron los biofilms maduros (48 h a 37 ºC) de cada una de las cepas en microplaca de 96 pocillos. Se evaluó la actividad de AU, de las NP Ag biosintetizadas, de AmB, y las combinaciones entre AU+AmB; NP Ag+AmB y AU+NP Ag sobre los biofilms maduros. Se cuantificó mediante la tinción con cristal violeta y se midió por espectrofotometría a 595nm.La densidad óptica (DO) se expresó como unidades de biomasa del biofilm (UBB), 0,1 DO595nm equivale a 1 UBB. A partir de los resultados de UBB, se calculó el porcentaje de crecimiento (%C) y el de reducción (%R) del biofilm sin tratar (control de crecimiento) y de los tratados. Además, tanto el biofilm control y como el tratado se observaron por microscopía óptica de campo brillante, de fluorescencia y confocal de exploración láser (MCEL). Todas las imágenes de microscopía se procesaron con ImageJ y se analizó la topografía y la arquitectura del biofilm mediante el software COMSTAT. Los datos fueron analizados mediante el análisis de la varianza (ANOVA) y se realizó el test de comparaciones múltiples Tukey. Fueron considerados significativos los resultados si *p<0,05, y para el test de Tukey si #p<0,05. La CIM del AU se determinó en 125 μg/ml para C. albicans, siendo la misma para C. tropicalis. La CIM de las NP Ag fue de 0,84 nM sólo para C. albicans. Por último, la CIM de AmB se determinó en 0,25 μg/ml en ambas cepas de Candida. En C. albicans, la UBB fue de 15 ± 0,14. Se determinó, para cada tratamiento, la concentración inhibitoria mínima que reduce el 50% del biofilm maduro (CIMS50), comparado con el biofilm no tratado. Las NP Ag a la concentración de 13,5 nM (16 veces más alta que en células planctónicas) mostraron una reducción del biofilm del 49% y AmB a 50 μg/ml (200 veces más alta que la CIM) redujo un 58% el biofilm (*p<0,05).Las combinaciones ensayadas con el AU (2,5 μg/ml), con las NP Ag (13,5 nM) y con AmB (50 μg/ml) erradicaron hasta el 56% del biofilm maduro con respecto al biofilm control (*p<0,05). En C. tropicalis, la UBB fue de 35 ± 0,34. AmB a 50 μg/ml redujo un 54% el biofilm (*p<0,05). La combinación AU + NP presentó una reducción similar (55%, *p<0,05) del biofilm, mientras que, las combinaciones AU+AmB y NP Ag+AmB alcanzaron una erradicación del 80% del biofilm maduro, resultando más efectivos que los tratamientos de los compuestos evaluados por separado (*p < 0,05; #p < 0,05). A través del análisis de las imágenes obtenidas por microscopías (campo brillante y MCEL) se observó que los tratamientos produjeron la reducción del espesor promedio y de la superficie adherida del biofilm de ambas cepas de Candida. El análisis COMSTAT mostró que en C. albicans los tratamientos produjeron disminuciones significativas de biomasa y espesor promedio. La combinación de NP Ag+AmB disminuyó la biomasa de 16,77 ± 5,45 μm3/μm2 (biofilm control) a 3,80 ± 0,27 μm3/μm2 (*p<0,05), respectivamente. De manera similar, el espesor promedio también disminuyó, mientras que el coeficiente de rugosidad (Ra*) aumentó (*p<0,05). En C. tropicalis, la biomasa del biofilm no tratado fue de 22,42 ± 5,78 μm3/μm2 y con el tratamiento de NP Ag+AmB se redujo a 1,44 ± 0,41 μm3/μm2 (*p<0,05; #p<0,05). El espesor promedio mostró reducciones significativas y el Ra* aumentó (*p