Criopreservación de ovocitos y embriones producidos in vitro

Tesis (Doctor en Ciencias Agropecuarias)--UNC- Facultad de Ciencias Agropecuarias, 2013.El objetivo de esta tesis fue evaluar la viabilidad de ovocitos y embriones bovinos producidos in vitro vitrificados por medio de sistemas de micro-volumen en soluciones simples de etilenglicol (EG). En el experimento 1, se evaluó la efectividad de la soluciones crioprotectoras, sobre la viabilidad de los embriones. Los resultados demostraron que las soluciones simples de EG tienen la capacidad de formación de estado vítreo y baja toxicidad, resultando en mayores tasas de supervivencia que con las soluciones compuestas por EG y propanediol (PROH). En el Experimento 2 fueron evaluados dos diferentes métodos de vitrificación: las micro-pipetas de vidrio (GMP) o la vitrificación sobre superficie sólida (CVM). No encontrándose diferencias entre los dos tipos de sistemas de vitrificación. En el experimento 3, se comparó la supervivencia de los embriones producidos in vivo e in vitro criopreservados por el método de vitrificación CVM o de congelamiento lento. Las viabilidad de los embriones in vivo fueron superiores a los de los embriones in vitro, sin importar el sistema de criopreservación. Además, el sistema CVM presentó mejores tasas de supervivencia de los embriones in vitro que con el método de congelamiento. En el experimento 4, se evaluó la viabilidad de los embriones después de ser descongelados en un sistema de dilución dentro de la pajuela, en la presencia o no de sacarosa. Los resultados demostraron que los embriones vitrificados en soluciones compuestas por EG-PROH, obtuvieron una viabilidad superior cuando los embriones fueron diluidos en sacarosa. Por último, en el experimento 5 se evaluó el efecto de la coloración Brillante Cresyl Blue (BCB) en la selección de ovocitos y la presencia de ácido hialuronico (HA) en las soluciones de vitrificación, sobre la viabilidad de ovocitos bovinos vitrificados. Los resultados demostraron que los ovocitos seleccionados como BCB(+) tuvieron mayores tasas de desarrollo que los BCB(-). Además, el uso de HA dentro de las soluciones de vitrificación no presento ningún efecto sobre las tasas de desarrollo. En conclusión, la vitrificación utilizando soluciones simples de EG proporciona la supervivencia embrionaria de ovocitos y embriones producidos in vitro y permite la utilización de sistemas simples de dilución para la transferencia directa de los embriones.The aim of this thesis was to evaluate the in vitro survival rates of bovine oocytes and embryos produced in vitro vitrified by micro-volume systems in simplified ethylene-glycol (EG) solutions. Experiment 1 evaluated the effectiveness of the EG simple or compound cryoprotectant solutions on embryo survival rates after vitrification. The results demonstrated the glass forming capacity of simplified solutions and its low toxicity, resulting in higher embryo survival rates in comparison with the compound solutions of EG and propanediol (PROH). Experiment 2, evaluated two different vitrification methods: glass micro-pipette (GMP) or solid surface vitrification (CVM). No differences were found between the two vitrification systems. Experiment 3, compared the embryo survival rates of in vivo and in vitro produced embryos cryopreserved by the CVM vitrification method or by the conventional slow freezing. Regardless the cryopreservation system used, embryo survival rates of the in vivo embryos were higher than the in vitro ones. Furthermore, the CVM method improved the survival rates of in vitro produced embryos in comparison with the conventional slow freezing. Experiment 4, evaluated the survival rates of embryos vitrified with the CVM method in which the vitrification media was diluted in the straw after warming using or not sucrose. The results demonstrated that embryos vitrified in EG simple solutions not show significant differences when were diluted in solutions with or without sucrose. However, the viability was higher with the sucrose solution when embryos were vitrified in EG and PROH solution. Finally, experiment 5 evaluated the effect of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining on oocyte selection and the use of hyaluronan in the vitrification solution, on embryo development of immature or mature oocytes that were vitrified with the CVM system. The results of this experiment demonstrated that the oocyte selected as BCB(+) had higher developmental rates than the oocytes selected as BCB(-). Furthermore, the use of hyaluronan in the vitrification solutions did not improve developmental rates. In conclusion, the vitrification by micro-volume using simplified EG cryoprotectant solutions provides embryo survival of oocytes and in vitro produced embryos, and allows the use of simplified systems for dilution of the vitrification media and for direct transfer