Determination of Rubisco enzyme content in leaves

Cieľom bakalárskej práce bola optimalizácia podmienok pre stanovenie obsahu enzýmu Rubisco metódou SDS-PAGE a stanovenie vhodného postupu extrakcie proteínov z rastlinného pletiva. Taktiež bolo stanovené aj rozmedzie koncentrácií Rubisco, v ktorých je daná metóda lineárna. Pre účely optimalizácie bolo testované delenie proteínov na géloch rôznej hustoty pri pôsobení rôzne veľkého napätia. V rámci práce boli otestované aj dva rôzne typy extrakcie proteínov s niekoľkými modifikáciami a to priama extrakcia do TRIS pufru a extrakcia metódou TCA/acetón. Najlepšie výsledky boli dosiahnuté pri separácii bielkovín na 8% géle a napätí 90 V, pokiaľ bolo na gél dávkovaných 5 µl vzorky. Za týchto podmienok bola zóna veľkej podjednotky enzýmu Rubisco dostatočne oddelená od ostatných zón, takže pri denzitometrickom hodnotení poskytovala kvalitné píky s dobrou základnou líniou. Linearita metódy za týchto podmienok bola v rozmedzí koncentrácií 0,125–1,0 mg enzýmu v 1 ml vzorky. Priama extrakcia enzýmu do TRIS pufru bola menej účinná ako vyzrážanie bielkovín kyselinou trichlóroctovou v acetóne s následným rozpustením zrazeniny. Rozpustenie zrazeniny proteínov bolo však obtiažne, najlepšie sa pritom osvedčil tiomočovinový vzorkový pufer podľa Amalraja et al. [17].The aim of the bachelor thesis was to optimize the conditions of the Rubisco enzyme quantity determination by the SDS-PAGE method and the determination of appropriate protein extraction method from plant tissue. Also the concentration range for which the method is linear was determined. Gels with different density ran under different voltages during the electrophoresis were tested for the aims of optimization. Also two different protein extraction methods were used. These were direct extraction to TRIS buffer and extraction with TCA/acetone method. The best results were obtained with protein separation on 8% gel and voltage of 90 V, while the volume of loaded sample was 5 µl. Under these conditions was the Rubisco great subunit band enough separated from the other protein bands, so that the densitometric evaluation provided better quality peaks with good baseline. The linearity of method under these conditions was in concentration range 0,125–1,0 mg of enzyme in 1 ml of sample. Direct extraction of the enzyme with TRIS buffer was less effective than the precipitation of proteins with trichloracetic acid in acetone followed with dissolution of the precipitate. The best buffer for the protein pellet dissolution was the thiourea buffer prepared according to Amalraj et al. [17]..