Analysis of bacteriophage E2 and its enzymes in the control of Escherichia coli biofilms

Tese de Mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019O aumento da incidência de bactérias Gram-negativas resistentes aos antibióticos como Escherichia coli, um patógeno oportunista envolvido em infeções associadas a cuidados de saúde, leva a que seja necessário que surjam terapias alternativas. A formação de biofilmes, um dos fatores de virulência mais relevantes de E. coli em ambiente clínico, protege-as contra antibióticos e respostas imunes do hospedeiro. Portanto, a capacidade das bactérias estabelecerem biofilmes representa um verdadeiro desafio terapêutico, ao qual é necessário dar resposta. Os bacteriófagos são uma alternativa promissora neste sentido. Este trabalho pretendeu descrever o isolamento e a caracterização de um bacteriófago de E. coli, E2. Este bacteriófago mostrou ter um espetro lítico alargado para várias estirpes de E. coli infetando 35 de 100 isolados clínicos, incluindo estirpes que codificam para beta-lactamases de espetro alargado. A análise bioinformática revelou que o genoma completo de E2 é constituído por 150542 pares de bases com um conteúdo em GC de 39.1%. Uma análise comparativa usando o programa BLASTn permitiu mostrar que E2 apresenta homologias significativas com uma série de outros bacteriófagos que infetam E. coli, todos membros da família Myoviridae. Estes dados juntamente com o facto de se ter previsto um número elevado de grelhas de leitura abertas para este bacteriófago, indicam que também E2 possivelmente se inclua nessa classificação. A análise comparativa da sequência amino acídica deduzida, usando o BLASTp, não identificou semelhanças significativas com proteínas associadas à virulência ou toxinas. Não foram também encontrados elementos genéticos associados a lisogenia, sugerindo que E2 será um bacteriófago virulento com potencial para ser aplicado em terapia. Numa fase seguinte do trabalho, foi testada a capacidade de E2 infetar culturas planctónicas do seu hospedeiro, a estirpe E. coli 1636/05, obtida a partir de um exsudado de queimadura. E2 promoveu uma forte redução de biomassa nos dois estados de crescimento considerados, exponencial e estacionário, após 60 e 100 minutos de infeção, respetivamente, com um máximo ao fim de 180 minutos que foi mantido até ao fim do ensaio. A capacidade do hospedeiro formar biofilme foi inicialmente estudada para que fosse possível avaliar o potencial deste bacteriófago no controlo dos mesmos. E2 causou um decréscimo significativo no número de células viáveis do biofilme (~ 2 log) após 2 e 6h de infeção. Recentemente, vários estudos evidenciaram que a coevolução de bacteriófagos e respetivos hospedeiros levou à expressão de depolimerases de polissacáridos que têm a capacidade de reconhecer, ligar e degradar compostos polissacáridos. Sendo assim, estes enzimas fornecem aos bacteriófagos as ferramentas para terem uma vantagem competitiva em nichos como os IV biofilmes. Logo, acredita-se que os bacteriófagos que codificam depolimerases possam ter uma melhor performance contra estas estruturas bacterianas. A presença de halos em torno das placas fágicas de E2, halos esses que cresceram perante incubação prolongada, mostrou que este bacteriófago possivelmente codificava este tipo de enzimas. Uma análise comparativa BLASTp indicou que ambos os produtos génicos da ORF197 e da ORF205, posteriormente chamados E2neu e E2col, respetivamente, apresentavam homologia significativa com outras depolimerases já reportadas e codificadas por bacteriófagos. E2neu revelou homologia com uma proteína contendo domínios conservados de endosialidase. O plasmídeo contendo o gene que codifica para esta proteína foi construído e esta foi expressa e purificada como uma proteína solúvel em E. coli BL21(DE3). E2col apresentou homologia quase completa com uma colanidase. Apesar deste potencial, todas as tentativas de construção de um plasmídeo contendo o gene que codifica para esta proteína não foram bem sucedidas. A atividade de E2neu foi avaliada usando um teste de ‘spot’ numa cultura de células hospedeiras. Os resultados revelaram a presença de um halo semi-transparente até com a quantidade mais reduzida de proteína, indicando que E2neu tem um efeito no camada bacteriana. Adicionalmente, foi também possível observar um comportamento dependente da dose. E2neu mostrou, portanto, ter capacidade para degradar o seu substrato natural. Um teste de coloração simples com tinta da china e violeta de cristal permitiu provar que a estirpe hospedeira era encapsulada. No entanto, apesar de não ter sido possível provar que o alvo de E2neu pertencesse ao grupo dos polissacáridos capsulares, crê-se que esta hipótese seja viável por duas razões. Tendo em conta o descrito na literatura, os resultados obtidos indicam que os polissacáridos capsulares possam ser os alvos desta depolimerase. Segundo, a análise bioinformática mostrou que E2neu continha alguma homologia com uma proteína contendo domínios conservado de endosialidase. As endosialidases têm a capacidade de degradar o ácido polissiálico, componente essencial das cápsulas de estirpes de E. coli do serotipo K1. Desta forma, estes dados sugerem que E. coli 1636/05 possa pertencer ao serotipo K1 suportando de igual forma o potencial que E2neu poderá ter no controlo de estirpes clinicamente relevantes pertencentes a este serotipo. Após esta análise, a atividade anti-biofilme de E2neu foi avaliada em biofilmes de E. coli 1636/05. E2neu foi incapaz de erradicar o biofilme contribuindo até para o seu crescimento, tanto em termos de biomassa total como em relação ao número de células viáveis. Tendo sido comprovado que esta estirpe era encapsulada, especulou-se que os polissacáridos capsulares pudessem estar a provocar um impedimento da ação de adesinas de superfície, componentes essenciais para o desenvolvimento do biofilme. Sendo assim, se E2neu estivesse efetivamente a exercer a sua atividade na cápsula de E. coli 1636/05, essas adesinas V estariam novamente expostas podendo contribuir para a maturação do biofilme. Isto vai de acordo com o que aconteceu no ensaio podendo constituir uma hipótese válida. Foi ainda testada uma última condição em que E2neu era aplicada no biofilme juntamente com E2 para verificar se a proteína poderia aumentar a capacidade de infeção do bacteriófago. No entanto, o número de células viáveis do biofilme manteve-se constante ao longo do tempo o que pode ter-se devido a dois fenómenos. Primeiro, sabe-se que os bacteriófagos por vezes utilizam polissacáridos capsulares como recetores, portanto, se esses polissacáridos forem degradados, os bacteriófagos não conseguem infetar o seu hospedeiro. Sabe-se também que todos os bacteriófagos que infetam estirpes de E. coli pertencentes ao serotipo K1 têm um recetor capsular. Ora, tendo visto anteriormente que E. coli 1636/05 poderá incluir-se nessa classificação, há uma forte possibilidade de esta ser uma explicação pertinente para os resultados obtidos. A segunda recai sobre aspetos estruturais do biofilme. Se E2neu promover a formação de um biofilme denso, como se viu acontecer anteriormente, este poderá atuar como uma barreira à difusão do bacteriófago. Se o bacteriófago não conseguir difundir-se para o interior do biofilme, não conseguirá também desenvolver o seu ciclo lítico e isso poderá constituir uma justificação alternativa para os resultados obtidos. Baseado nestes resultados, E2neu precisa de ser estudada mais profundamente em diversos aspetos. É necessário, primeiro que tudo, identificar qual é efetivamente o substrato sobre o qual este enzima atua. Apesar destes resultados indicarem que possivelmente este enzima atua sobre os polissacáridos capsulares, teriam de ser realizados ensaios de coloração específicos para estudar se realmente E2neu tem influência sobre esta estrutura. Posteriormente, se efetivamente se comprovasse que o substrato natural do enzima eram os polissacáridos capsulares, seria interessante fazer ensaios com soro humano, para avaliar se uma possível degradação da cápsula teria capacidade para sensibilizar as estirpes a uma resposta imune, bem como ensaios de sinergia com antibióticos visto que já foram reportadas respostas eficientes com vários binómios depolimerase/antibiótico noutros estudos. Apesar destes resultados constituírem tremendo potencial, só assim se poderá verificar se realmente E2neu será um potencial agente para o controlo de biofilmes de E. coli.The rise of antibiotic-resistant Gram-negative bacteria such as Escherichia coli, an opportunistic pathogen thoroughly involved in healthcare-associated infections, prompts the need for alternative therapies. Biofilm development, one of the most relevant virulence factors of E. coli in the clinical setting, protects bacteria against antibiotics and host immune responses. Therefore, the ability of bacteria to establish biofilms represents a serious medical challenge that needs innovative solutions. Bacteriophages are a promising alternative for this purpose. This work described the isolation and characterization of an E. coli bacteriophage, E2, capable of infecting 35 out of 100 E. coli clinical strains. Additionally, E2 potential for planktonic and biofilm control of its host, E. coli 1636/05, was evaluated. E2 promoted strong biomass reduction of its host planktonic cells. When tested in biofilm, E2 also caused a significant decrease of viable cell counts (~ 2 log) after 2 and 6h of infection. Nevertheless, after 24h of treatment, a significant increase in the number of viable cells was observed. More recently, several works evidenced that the co-evolution of bacteriophages and their host bacteria has resulted in the expression of polysaccharide depolymerases by the bacteriophage which have the potential to identify and degrade polysaccharide compounds. Consequently, it is thought that bacteriophages encoding these enzymes might have a competitive advantage against bacterial biofilms. The presence of haloes around E2 plaques, which increased in size after prolonged incubation, pointed out that this bacteriophage could possibly encode this type of enzymes. A BLAST analysis indicated that both ORF197 and ORF205 predicted gene products, later called E2neu and E2col, respectively, had significant homology with other reported bacteriophage-encoded depolymerases. E2neu, a putative endosialidase, was expressed and purified as a soluble protein using E. coli BL21(DE3). E2col, a putative colanidase, could not be expressed since it was impossible to clone its gene. E2neu potential for biofilm control was also tested. E2neu individual activity promoted a degradation of its natural substrate in a spot test but it was unable to promote biofilm eradication, contributing even to its development. E2neu activity in combination with E2 showed no significant effects on the biofilm over time. Based on these results, it is possible to conclude that E2 is a potential agent for E. coli biofilm control. However, further studies need to be done with E2neu in order to see if it could also represent a potential agent for E. coli biofilm control.This work was developed at Technophage SA, at the Antibiotic Resistance Laboratory, CIISA, Faculty of Veterinary Medicine, University of Lisbon and at the Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa), Faculty of Pharmacy, University of Lisbon. This project was funded by Technophage S