Axonale Zielfindung im Hippocampus während der Entwicklung und nach Läsion

Die vorliegende Arbeit behandelte den Einfluss von membran-assoziierten Faktoren im Hippocampus auf das axonale Wachstum, zum einen während der Entwicklung des entorhino-hippocampalen Systems und zum anderen nach Deafferenzierung des adulten Hippocampus. Mit Hilfe des Streifenassays und des Längenauswachsassays wurden zuerst die maturationsabhängigen Eigenschaften von membran-assoziierten Faktoren im Hippocampus getestet. Es zeigte sich, dass entorhinale Axone zwischen ihrem normotypischen Zielgebiet und Kontrollregionen diskrimieren können und bevorzugt auf Membranen ihres Zielgebiets wachsen. Im Folgenden wurden dann Axonen hippocampale Membranen unterschiedlicher Entwicklungsstadien im Streifenassay angeboten. In diesem experimentellen Ansatz wuchsen entorhinale Axone präferenziell auf jenen hippocampalen Membranen, die aus dem Entwicklungsstadium stammen, in den die entorhinalen Fasern in vivo in den Hippocampus einwachsen. Diese Experimente ergaben, dass das in vivo zeitlich genau regulierte Einwachsen entorhinaler Fasern in den Hippocampus von membran-assoziierten Faktoren determiniert ist und ein Zeitfenster für das Vorhandensein dieser Faktoren im Hippocampus existiert. Eines der wesentlichen Charakteristika der Maturation des zentralen Nervensystem ist die Bildung von Myelin und die Myelinisierung von Fasertrakten. Immunozytochemische Analysen mit Myelin-spezifischen Markern ergaben, dass dieses maturationsabhängige Auswachsverhalten zeitlich gut mit der Myelinisierung dieser Hirnregion korreliert. Eine Reihe von in vivo und in vitro Experimenten verschiedener Arbeitsgruppen demonstrierten, dass Myelin starke auswachsinhibitorische Eigenschaften hat, die sogar den Kollaps von Wachstumskolben induzieren können. In Längenauswachsassays zeigte sich, dass Myelin einen starken inhibitorischen Effekt auf das Längenwachstum von entorhinalen Axonen hat. Mit physikalischen Separationstechniken und unter Verwendung des funktionellen Antikörpers gegen inhibitorische Myelinproteine (IN-1) konnte dieser Effekt neutralisiert werden und das neuronale Längenwachstum war wieder vergleichbar zur Kontrollsituation. Untersuchungen im Streifenassay ergaben zusätzlich, dass das wachstumsinhibitorische Myelin und seine Komponenten keine axonalen Lenkungseigenschaften hatte und die gerichtete Zielfindung axonalen Auswachsens nicht beeinflusst. In weiteren Experimenten wurden die membran-assoziierten Faktoren im deafferenzierten Hippocampus untersucht. Dabei zeigte sich, dass nach einer Läsion wachstumsfördernde Faktoren in hippocampalen Membranen vorliegen. Zusätzlich liegen in einem engen Zeitfenster axonale Lenkungsmoleküle vor mit vergleichbarer Attraktivität für entorhinale Axone, wie sie aus entsprechenden Entwicklungsstadien bekannt sind. Die Experimente lassen den Schluss zu, dass im deafferenzierten Hippocampus Faktoren läsionsinduziert werden, und dass diese Faktoren membran-assoziiert sind. Es wird seit langem angenommen, dass das ZNS von adulten Vertebraten in seinem zellulären Zustand determiniert ist und zu keinen grösseren plastischen Veränderungen fähig ist. Gerade nach einer Schädigung von adultem ZNS ist die Regenerationsfähigkeit im Unterschied zu jungen, postnatalen ZNS sehr eingeschränkt. Die beschränkte Regenerationsfähigkeit des adulten ZNS ist wesentlich determiniert durch die Präsenz des auswachsinhibitorischen Myelins. Nichtsdestotrotz gibt es kompensatorisches Sprouting im Hippocampus, die verlorengegangene synaptische Kontakte ersetzen. Die Identifizierung der Faktoren, die das schichten-spezifische Einwachsen aussprossender Axone kontrollieren, trägt wesentlich zum Verständnis dieses Phänomens bei. Weiterhin wird die Aufklärung der zugrundeliegenden molekularen Faktoren für die spezifische Zielerkennung und deren Charakterisierung uns helfen, das Potential und die Limitation der Regeneration im ZNS besser zu verstehen und die Möglichkeit eröffnen, einmal verlorengegangene neuronale Verbindungen durch therapeutische Intervention wieder spezifisch aufzubauen.In this study, the impact of membrane-associated factors on axonal outgrowth during development and following lesion was examined. We studied the maturation-dependent features of membrane-associated molecules in the hippocampus with the stripe assay for guidance activity and with the outgrowth assay for outgrowth-supporting activity. We could show that entorhinal axons discriminate between their proper target area, the hippocampus, and control regions which do not receive synaptic connections from the entorhinal cortex, and preferred to grow on hippocampal membranes. Further, we examined guidance preferences of entorhinal neurites on hippocampal membranes in different developmental stages. The choice behavior of entorhinal neurites for hippocampal membranes temporally correlates with the ingrowth of the perforant path into the hippocampus and with the stabilization of this brain area in vivo, and further indicate the transient presence of membrane-associated guidance cues in the hippocampus. One of the characteristics of maturational processes in the central nervous system is the developmentally regulated myelination of fiber tracts. Comparison of the stripe assay data with immunohistochemical analysis for MBP and MAG as representative myelin markers revealed a correlation between the changes in axonal choice behavior and increasing myelination. It is known that myelin itself is a strong axonal outgrowth inhibitor and that myelin can also induce growth cone collapse. In outgrowth assays, we could show that myelin has a strong outgrowth inhibitory influence on entorhinal axons which can be neutralized by the monoclonal antibody IN-1. However, in the stripe assay, myelin did not influence the choice behavior of outgrowing axons and this indicates that myelin does not govern information for directed growth. Furthermore, stripe assays were performed with membranes obtained from deafferented hippocampi at various lesion stages. In these experiments, we could show that outgrowth-promoting factors are present in the lesioned hippocampus. Moreover, data from the stripe assay revealed the timely restricted presence of membrane-bound guidance factors which are equally as attractive as neonatal hippocampal membranes. These experiments indicate the lesion-induced expression of outgrowth-promoting factors in the hippocampus, which correlates temporally with the sprouting reaction in vivo. It is suggested that the central nervous system of adult vertebrates is determined in its cellular condition and not capable of structural changes. This is most evident following lesion of adult brain, where the ability for regeneration is highly restricted in comparison to young, postnatal neural tissue. This restricted ability for regeneration in the adult brain is essentially determined by the presence of outgrowth-inhibitory myelin. However, a compensatory sprouting response exists in the adult hippocampus following lesion, which leads to a layer-specific replacement of lost synaptic contacts. The identification of these factors will lead to a deeper understanding of layer-specific axonal sprouting and synaptic replacement. Further, the identification and characterization of the underlying factors will help us to understand the potential and limitations of regeneration in the central nervous system