Functional characterization of cancer- and RASopathies-associated SHP2 and BRAF mutations

Deregulierung des RAS/MAPK Signalwegs führen nicht nur zur Krebsentstehung, sondern sind auch mitverantwortlich für Entwicklungsstörungen, dieals Keimbahnmutationen in Schlüsselregulatoren des MAPK Signalwegs zurückzuführen sind, werden aufgrund überlappender Phänotypen unter dem Begriff RASopathien subsumiert. Obwohl die Inzidenz für solide Tumore bei diesen Patienten gering ist, wird ein Zusammenhang zum Auftreten verschiedener Leukämieformen deutlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Mutationen zweier Schlüsselregulatoren des MAPK Signalwegs, PTPN11 und BRAF, hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur neoplastischen Transformation analysiert. Zur Durchführung funktioneller Assays wurden Zelllinien mit lentiviraler Vektoren mit NS-, LS- oder NS und Leukämie-assoziierten SHP2 oder CFC-assoz. BRAF Mutationen (Mut), generiert. Die Testung des neoplastischen Potentials erfolgte anhand nicht-tumorigenen humanen sowie an 208F Ratten-Zelllinie. SHP2/BRAF-Mutationen haben eine spindel-ähnliche Zellmorphologie, Proliferation sowie das Dichte- und Anker-unabhängiges Wachstum in 208F gefördert. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass RASopathie-assoziierte Mutationen zu einem Transformationsphänotyp führen können, ähnlich wie die klassischen Ras Onkogenen. Um zu testen, ob Mut-SHP2 das in vivo Tumorwachstum beeinflusst, wurden SHP2-208F-Zellen in Nacktmäuse injiziert. Eine Förderung des Tumorwachstums konnte sowohl durch mut- als auch durch wt-SHP2 beobachtet werden. RASopathie-assoziierte mutierte Proteine führten auch zu einer moderaten Aktivierung des MAPK-Signalwegs. Eine erhöhte Bindungsstärke zu GAB1 konnte mittels ein TAP-Assay ermittelt werden. Auf transkriptioneller Ebene konnte einer Gensignatur, die sowohl durch RASopathien als auch der klassischen onkogenen BRAF identifiziert werden.Die Ergebnisse dieser Studie können für ein besseres Verständnis der Downstream-liegenden Mechanismen von RASopathie-bezogenen Signalwegen und ihrer Beteiligung an der Tumorprogression beitragenDeregulation of the Ras/MAPK signaling is implicated in a variety of human diseases, including cancer and developmental disorders. The RASopathies are characterized by an overlapping phenotype in patients and result from germline mutations in key regulators of the MAPK signaling cascade. Although the incidence of solid tumors is rather low, reports on different leukemia forms have increased. In this work, a group of mutations in the genes PTPN11 and BRAF were selected for expression in cell lines for a comprehensive molecular and phenotypic characterization. Non-tumorigenic human cell lines and the rat 208F fibroblasts were transduced with lentiviral particles with SHP2/BRAF wildtype (wt), Noonan (NS)-, NS- and leukemia- or LS–associated SHP2 mutations (mut) and CFC-associated BRAF mutations to identify their potential roles in neoplastic transformation. Mutations in both genes promoted cell morphology alterations, cell proliferation, density- and anchorage-independent growth in rat fibroblasts. These results suggested that RASopathies-associated mutations in both genes confer a transformation phenotype in vitro similar to the classical oncogenes. To investigate whether mutations in SHP2 contribute to tumor growth in vivo, 208F cells expressing wt/mut SHP2 were injected in nude mice. Both wt/mut SHP2 expressing cells promoted tumor growth. Additionally, RASopathies-associated mutant SHP2 and BRAF proteins constitutively activate the MAPK signaling in a moderate manner compared to oncogenic BRAF. To identify modifications in the protein interaction of mut-SHP2, TAP assays were performed. Mut-SHP2 proteins showed an increased binding strength to GAB1 compared to wt. Finally, a microarray analysis revealed a gene cluster commonly regulated in both RASopathies and the oncogenic BRAF. The findings of this work might be useful for a better understanding of the downstream mechanisms of RASopathies-related signaling and their involvement in cancer progression