Femtosecond stimulated resonance Raman spectroscopy

Femtosekundenaufgelöste Ramanspektroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Schwingungsentwicklung eines angeregten Chromophors in Echtzeit zu studieren. In dieser Arbeit wurde ein durchstimmbares Ramanspektrometer mit 10 cm-1 spektraler und 50--100 fs zeitlicher Auflösung entwickelt und für eine Anwendung auf flavinbasierte Photorezeptoren optimiert. Es wird der Einfluß der Resonanzbedingungen auf das transientes Ramanspektrum charakterisiert. Die Dynamik des angeregten Zustandes wird zuerst für den Modellphotoschalter Stilben untersucht, ausgehend sowohl vom cis-, als auch vom trans-Isomer. Intensitätsabnahme, spektrale Verschiebung und Bandenverschmälerung liefern Einblicke in die Schwingungsrelaxation des angeregten Chromophors. Wellenpaketbewegung und anharmonische Kopplung werden als Oszillationen beobachtet. Für das "Mutter"-Cyanin 1,1''-Diethyl-2,2''-pyridocyaniniodid wird die Isomerisierung bis in den Grundzustand verfolgt. Ramanspektren des Franck-Condon-Zustandes, des intermediär gebildeten heissen Grundzustandes und der Isomerisierungsprodukte werden erhalten. Als Grundlage für Experimente an Flavoproteinen werden die Eigenschaften des angeregten Flavinchromophors in Lösung untersucht. Transiente Absorptions- und Fluoreszenzexperimente weisen auf den Einfluss dynamischer polarer Solvatation hin. Es werden Ramanspektren des angeregten Zustandes von Flavin aufgenommen und die Schwingungsbanden zugeordnet. Populationsverminderung durch den Ramanimpuls wird als potentielles Artefakt in zeitaufgelösten Messungen identifiziert; der Effekt wird aber auch genutzt, um Wellenpaketbewegung im angeregten Zustand zu markieren. Die Photorezeptormutanten BlrB-L66F und Slr1694-Y8F werden mit transienter Absorption studiert. Dabei wird die Bildung des Signalzustandes und Flavinreduktion durch ein Tryptophan beobachtet. Die Anwendung des entwickelten Ramanspektrometers auf biologische Proben wird in einem ersten Experiment an Glucose Oxidase demonstriert.Femtosecond stimulated Raman spectroscopy is a powerful tool that allows to study the structural relaxation of an excited chromophore directly in time. In this work a tunable Raman spectrometer with 10 cm-1 spectral and 50-100 fs temporal resolution was developed, and the technique was advanced towards applications to flavin-based proteins. With this device the influence of resonance conditions on the transient Raman spectrum is characterized. Excited-state dynamics is first investigated for the model photoswitch stilbene, starting from both the cis and the trans isomers. Decay, spectral shift, and narrowing of individual bands provide insight into the vibrational relaxation of the excited chromophore. Wavepacket motion and anharmonic coupling is seen as oscillations. Isomerization is followed to the ground state for the "parent" cyanine 1,1''-diethyl-2,2''-pyrido cyanine iodide. From a global analysis, Raman spectra for the Franck-Condon region, the intermediately populated hot ground state, and the isomerization products are obtained. As a basis for experiments on flavoproteins, the excited-state properties of the pure flavin chromophore are studied in solution. Transient absorption and fluorescence experiments suggest an influence of dynamic polar solvation on the electronic properties of the excited state. Raman spectra from the flavin excited state are recorded and the vibrational bands assigned. Population depletion by the Raman pulse is identified as a potential artefact, but the effect is also used to mark wavepacket motion in the excited state. The photoreceptor mutants BlrB-L66F and Slr1694-Y8F are studied by transient absorption; signaling state formation and flavin reduction by a semiconserved tryptophan are seen, respectively. The application of femtosecond Raman spectroscopy to biological samples is demonstrated in a first experiment on glucose oxidase