Untersuchungen zur Expression und Inhibition von Orthopockenvirus-Genen

Nicht nur die mögliche Verwendung von Variolavirus als bioterroristischer Kampfstoff sondern auch das zoonotische Potential pathogener Pockenviren wird als eine erhebliche Gefahr für das öffentliche Gesundheitswesen diskutiert. Zurzeit liegt in der Bevölkerung kein ausreichender Impfschutz vor. Mit Ausnahme der Expositionsprophylaxe steht die Vakzination als einzige Prävention zur Verfügung, von der bekannt ist, dass sie mit erheblichen Impfkomplikationen assoziiert ist. Therapeutische Ansätze sind deshalb von großem Interesse. In dieser Arbeit wurden HEp-2-Zellen mit den Orthopockenviren (OPV) VACV-LE, VACV-MVA-BN, CMLV-CP-19 und Calpoxvirus sowie die Zelllinien 293, A-549, Huh-7 und HSB-2 mit Calpoxvirus infiziert und der Replikationszyklus analysiert. Die Genexpression von Faktoren der Transkription (D7R), der DNA-Replikation (K4L) oder für Strukturproteine (D8L, A56R, A27L) wurde unabhängig vom untersuchten Virus und der Zelllinie gleich reguliert, was auf eine wichtige Rolle während der Virusreplikation hinweist. Ferner wurde ein siRNA-System zur Hemmung der OPV-Gene D7R, K4L, D8L, A56R und A27L etabliert. Die Transkription von D7R, K4L, D8L und A27L wurde in infizierten Zellen effektiv durch spezifisch eingesetzte shRNAs inhibiert und dadurch die Virusreplikation von Calpoxvirus im Vergleich zu den Kontrollzellen 24 und 48 Stunden nach der Infektion gehemmt. Die Inhibition der A27L-Genexpression wurde zusätzlich im Western Blot für Calpoxvirus- und VACV-LE-infizierte 293-Zellen nachgewiesen. A56R wurde weder für die Replikation von Calpoxvirus noch von VACV-LE in der Zellkultur benötigt. Da die Gene D7R, K4L, D8L und A27L essentiell für die Replikation von OPV in der Zellkultur waren, könnten sie potentielle Zielstrukturen für die Entwicklung von antiviralen Substanzen für die Behandlung einer OPV-Infektion darstellen.Not only the potential use of smallpox in a bioterrorist attack but also the zoonotic potential of other poxviruses infecting animals are discussed to be a public health threat. At present, there is no sufficient protection in the human population provided by vaccination. Prophylactic vaccination was effective but has been associated with serious adverse effects. No proven drug treatment is available. Therefore, therapies and new treatment strategies are greatly needed. In this study HEp-2 cells were infected with the orthopoxviruses (OPV) VACV-LE, VACV-MVA-BN, CMLV-CP-19 and Calpoxvirus. In addition, the cell lines 293, A-549, Huh-7 and HSB-2 were infected with Calpoxvirus alone to determine the OPV replication cycle. Irrespective of the analyzed virus and cell line gene expression was regulated similarly for factors involved in transcription (D7R), DNA replication (K4L) or for structural proteins (D8R, A56R, A27L), indicating an important role in virus replication. Furthermore, a siRNA-system for the inhibition of the OPV genes D7R, K4L, D8L, A56R and A27L was established. It could be shown, that specific shRNAs effectively inhibited transcription of D7R, K4L, D8L and A27L in infected cells and repressed Calpoxvirus replication 24 and 48 hours post infection in comparison to control cells. In addition, the inhibition of A27L gene expression was shown in Western Blot analyses for Calpoxvirus- and VACV-LE-infected 293 cells. A56R is not required for virus replication of Calpoxvirus and VACV-LE in cell culture. Since D7R, K4L, D8L and A27L seem to be essential for OPV replication in cell culture, these OPV genes might serve as potential targets for the development of antiviral substances for the treatment of OPV infections