Characterization of Aus1 protein

Sterine sind essentielle Komponenten der Zellmembran, deren Konzentration und Lokalisierung genau kontrolliert wird. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist ein fakultativ anaerober Organismus, der in Abwesenheit von Sauerstoff auxotroph für Sterine wird. Die Proteine Aus1p und Pdr11p gehören zur Familie der ABC Proteine und spielen eine wichtige Rolle in diesem Prozess, da die gleichzeitige Deletion beider Protein die Aufnahme von Sterinen unter anaeroben Wachstumsbedingungen blockiert.In dieser Arbeit wurde das Gen AUS1 in voller Länge kloniert. Methoden für die Extraktion und Reinigung dieses Transporters wurden entwickelt, damit dieser detailliert charakterisiert werden kann. Mit Hilfe von Detergenzien wurde das Protein löslich gemacht und zeigte ATP-Bindung und -Hydrolyse. Die ATP-Hydrolyse konnte durch die Mutation eines konservierten Lysins zu Methionin im Walker A Motif verhindert. Genauso konnte die ATP-Hydrolyse auch durch klassische Inhibitoren von ABC Transportern inhibiert werden. Nach der Rekonstitution von Aus1p in Proteoliposomen wurde die ATPase Aktivität spezifisch durch Phosphatidylserin in einer stereoselektiven Weise stimuliert.Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Änderungen im zellulären PS Spiegel die Aus1p-abhängige Aufnahme von Sterin an die Membran beeinflussen. Diese Ergebnisse schlagen eine für die Aktivität des Transporters wichtige, direkte Interaktion zwischen Aus1p und PS vor.Da es sich bei der Aufnahme von Sterin um einen komplexen Prozess handelt, könnten Komponenten exisitieren, die mit Aus1p interagieren. Der Hefestamm, der die Immunpräzipitation von Aus1p mit seinem Interaktionspartner ermöglicht, wurde erzeugt und der Einfluß von Mannoproteinen auf Sterinaufnahme wurde getestet. Außerdem wurde eine Methode entwickelt, mit der Aus1p in Giant Unilamellar Vesicles rekonstituiert werden kann. Mit diesen Liposomen kann das Verhalten und die Aktivität von Aus1p in Membranen mit einer komplexen Lipidzusammensetzung untersucht werden.Sterols are essential components of cellular membranes and their concentration and localization are tightly controlled. Saccharomyces cerevisiae is a facultative anaerobic organism which becomes auxotrophic for sterols in the absence of oxygen. However, the precise mechanism of sterol uptake remains to be revealed. Two proteins belonging to ABC protein family, Aus1p and Pdr11p were proposed to play a critical role in this process as simultaneous deletion of both of them blocks sterol uptake under anaerobiosis. In the present work, the full length AUS1 gene was cloned. An extraction and purification procedures were then developed to allow for detailed characterization of the transporter. The detergent solubilized protein was shown to bind and hydrolyse ATP. Mutagenesis of the conserved lysine to methionine in the Walker A motif abolished ATP hydrolysis. Likewise, ATP hydrolysis was inhibited by classical inhibitors of ABC transporters. Upon reconstitution into proteoliposomes, the ATPase activity of Aus1p was specifically stimulated by phosphatidylserine (PS) in a stereoselective manner. Furthermore, it was demonstrated that Aus1p-dependent sterol uptake, but not Aus1p expression and trafficking to the plasma membrane, was affected by changes in cellular PS levels. These results suggest a direct interaction between Aus1p and PS which is critical for the activity of the transporter. Because of the complexity of sterol incorporation process efforts were made to identify additional components of the sterol uptake machinery that interact with Aus1p protein. The yeast strain allowing for immunopercipitation of Aus1p with its interaction partners was generated and previously proposed influence of mannoproteins on the sterol uptake was tested. Additionally, method was developed to reconstitute Aus1p protein into Giant Unilamellar Vesicles. These liposomes can be used further for testing of the behaviour and activity of Aus1p in the membranes with complex lipid composition