Caracterización Molecular Y Epidemiológica de Cepas Monofásicas de Salmonella Enterica

225 p.La salmonelosis, producida por bacterias del género Salmonella, es una de las intoxicaciones alimentarias más comunes en los países desarrollados siendo la principal manifestación la gastroenteritis aguda. Salmonella enterica es un patógeno conocido desde el siglo XIX y en la actualidad hay descritos más de 2.500 serotipos. Sin embargo no todos han tenido la misma relevancia y por tanto, son los más frecuentemente aislados en muestras clínicas los que han recibido un control y seguimiento epidemiológico más exhaustivo. La virulencia de Salmonella es muy compleja y varía enormemente entre serotipos y cepas dentro de un mismo serotipo. Si bien es cierto que la aparición de nuevas variantes monofásicas no es un evento exclusivo de los últimos años, las herramientas disponibles actualmente en biología molecular han facilitado la identificación de un mayor número de variantes no caracterizadas previamente. El trabajo de esta tesis doctoral se centró en la caracterización molecular de aislamientos de la variante monofásica 4,[5],12:i:- del serotipo Typhimurium circulantes en nuestro país así como de otros aislamientos monofásicos con importancia clínica en los últimos años: 4,5,12:b:- y 4,12:d:-, tratando de identificar su posible origen evolutivo. Del mismo modo y como segundo objetivo se planteó el ofrecer las herramientas epidemiológicas diseñadas y utilizadas en el transcurso de este proyecto de investigación para favorecer la detección, control y seguimiento de estas nuevas variantes monofásicas. El origen y posterior evolución de las variantes caracterizadas en este trabajo son el resultado de la evolución biológica fundamentada en las mutaciones espontáneas, la selección y el aislamiento en las que puede verse implicada la transposición de elementos genéticos móviles. Los elementos genéticos transponibles o transposones, se descubrieron por primera vez en la década de los 70 siendo la primera secuencia de inserción identificada la IS1 en E. coli. Las secuencias de inserción aparecían como constituyentes normales del cromosoma o de los plásmidos de las bacterias Gram-negativas. Habitualmente las IS muestran una preferencia en la inserción en determinadas regiones del ADN, lo cual sugiere que los extremos terminales de las IS pueden reconocer determinadas secuencias diana presentes en el cromosoma durante el proceso de inserción. En este trabajo se han caracterizado cuatro colecciones de aislados con las fórmulas antigénicas 4,[5],12:i:-, 4,5,12:b:- y 4,12:d:-, mediante fagotipificación, antibiotipificación, PFGE, MLVA, PCR y secuenciación. Con los datos obtenidos se ha podido concluir que las cepas de las colecciones 1 y 2 provienen de Salmonella Typhimurium, sin embargo entre ellas se diferencian diferentes líneas evolutivas. La primera colección está configurada por un clon procedente de una cepa de Salmonella Typhimurium U302 con plásmido pU302L y con perfil de multirresistencia R- ACSuGSTSxT, donde la tercera copia de IS26 del plásmido pU302L al reconocer una secuencia en el cromosoma originaría la deleción del flagelo de segunda fase y este evento habría ocurrido al menos en tres ocasiones diferentes comenzando siempre la deleción en el mismo punto. La alta homogeneidad detectada las clasifica como pertenecientes a un mismo clon denominado por otros autores cómo clon español. En la segunda colección se diferencian las otras dos líneas, dónde las tres primeras cepas de la colección son muy similares a las cepas descritas en Estados Unidos y a su vez diferenciables del resto de aislados de nuestro país, señalando un origen o ancestro común con las cepas monofásicas americanas. El resto de cepas caracterizadas en la segunda colección con deleciones de menor tamaño, únicamente comparten entre ellas el perfil de tetrarresistencia y el punto final de inserción de la secuencia IS26 señalando las características principales del clon europeo. Sin embargo las diferencias mostradas por el PFGE, MLVA y PCR de la deleción muestran que no comparten un origen común próximo en el tiempo pero si están más estrechamente relacionadas entre ellas que con las otras dos líneas descritas. En esta colección se han detectado tres aislados monofásicos cuya fórmula antigénica señala la falta del flagelo de segunda fase, pero por PCR y secuenciación se comprobó que aún conservan el gen fljB seguido de varias secuencias IS26, estas cepas podrían ser similares al ancestro del que evolucionarían las variantes de la colección. Las cepas de Salmonella enterica 4,5,12:b:- analizadas en la tercera colección de este trabajo, son variantes monofásicas provenientes de una tercera línea clonal de Salmonella Paratyphi B dT(+) sin resistencias a antimicrobianos, con la excepción de una cepa que no es capaz de metabolizar el tartrato (dT-), que provendría de Salmonella Paratyphi B dT(-). A pesar de haber caracterizado la deleción en la mayoría de los aislados no se han obtenido suficientes datos que permitan conocer el evento genético implicado en la misma. La mayoría presentan una deleción de 27 genes adyacentes al gen fljB, la cual pudo ser ocasionada por una transposasa, pero que posteriormente perdió parte de su estructura dejando un fragmento inservible de 281 pb. El PFGE muestra una elevada diversidad entre las cepas de esta variante. Sin embargo dentro del pulsotipo A, las cepas presentaron una alta homología e incluso son las que presentaron la deleción descrita. Entre los otros cuatro pulsotipos se engloban las cepas cuya deleción no se pudo caracterizar, por lo que nos llevó a concluir que estas 10 cepas podrían pertenecer a diferentes líneas evolutivas y por lo tanto presentar diferentes tipos de deleciones de los genes implicados en la síntesis del flagelo de segunda fase. Las cepas de Salmonella enterica 4,12:d:- que configuran la cuarta colección son variantes monofásicas provenientes de Salmonella Schwarzengrund, altamente homogéneas por lo que podrían configurar un mismo clon y en cuyo caso la deleción de once genes entre los que se encuentran los genes implicados en la síntesis del flagelo de segunda fase, fue originada por una IS30. Esta variante mostro una alta homogeneidad tanto en los datos de PFGE, como antibiograma y como en el tipo de deleción caracterizada. El final de la inserción de la IS30 coincide en el mismo nucleótido que el final de la inserción descrito en las cepas del clon europeo. Finalmente como conclusión a este trabajo podemos afirmar que la zona de síntesis del flagelo de segunda fase supone un punto caliente para las inserciones de secuencias de inserción o transposones afectando a la capacidad de síntesis de la flagelina de segunda fase en cepas de Salmonella enterica. Sin embargo, esta deficiencia, no ha supuesto una desventaja evolutiva para este tipo de variantes.UPV/EH