Molecular genetics of resilience

Dissertação de Mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2016.Defendida e aprovada em 13 de Dezembro de 2016.Trabalho de investigação realizado no Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças não Transmissíveis do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, Grupo de Neurogenética e Saúde Mental (Outubro 2015 - Setembro 2016).Orientadora Astrid Moura Vicente: Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças não Transmissíveis do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo JorgeResilience is a personality trait defined as the capacity to adaptively overcome stress and adversity while maintaining normal psychological and physical functioning. The study of resilience is of great interest and promise as it can provide insight on the genetics that underlie some personality traits and psychiatric disorders, like post-traumatic stress disorder (PTSD) and help identify candidate genes that could potentially be used as markers for medical testing, as well as protective factors that can help promote resilience. Although the complex mechanisms that underlie resilient phenotypes are not yet fully understood, evidence suggests that an individual’s genetic make-up and the interaction with environmental factors shape the neurochemical and neurological systems, mainly the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis, the noradrenergic system, and the serotonergic and dopaminergic systems, therefore modulating the variability in stress resilience. As such, the vast majority of the association studies relative to resilience have focused on genes linked to these systems. In this study, we genotyped 261 Portuguese individuals for genes and polymorphisms that had been formerly linked to resilience or psychiatric disorders and tested the results for association with the resilience scores previously obtained, considering as well other psychosocial characteristics. The analysis revealed an association between positive emotions and the absence of psychological symptomology associated to stress and higher resilience, which is demonstrative of the impact of a positive mind-set and a flexible biological stress response on resilience variability. After adjusting for all confounding non-genetic variables, it was also noticeable an association between the rs53576 (G>A) polymorphism of the OXTR gene, as well as the SLC6A3 40 bp VNTR and resilience, with the risk alleles of each polymorphism being associated with lower resilience, therefore indicating a functional impact of these variants on the stress response mechanism and demonstrating their influence on resilience variability. In conclusion, this study points to the influence of genetic factors as well as environmental factors on resilience, and the importance of studying these two components to truly understand this complex trait.Resiliência é a capacidade de ultrapassar situações de stress e adversidade de modo adaptativo, mantendo um funcionamento psicológico e físico normal. Como característica intrínseca, a resiliência é influenciada por variáveis externas, como a experiência pessoal e o suporte social, mas também por fatores genéticos que conferem suscetibilidade ou resistência, revelando assim a enorme complexidade por detrás da genética das variações comportamentais e doenças do foro psicológico. Embora os mecanismos subjacentes à resiliência ainda não estejam bem definidos, tudo indica que a predisposição genética do indivíduo juntamente com a interação com fatores ambientais modulam os sistemas neurológicos e neuroquímicos, nomeadamente o eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA), o sistema noradrenérgico e os sistemas serotonérgico e dopaminérgico, desta forma levando à variabilidade na resiliência ao stress. Deste modo, a maioria dos estudos de associação genética relativos a este traço psicológico têm recaído sobre os genes relacionados com estes sistemas. O eixo HPA é o coordenador central dos sistemas neuroendócrinos de resposta ao stress, tal como o sistema nervoso central, o sistema metabólico e o sistema imunitário, através de uma resposta em cascata iniciada no hipotálamo que liberta a hormona libertadora de corticotrofina (CRH), que estimula a libertação da hormona adrenocorticotropica (ACTH) por parte da pituitária, e que consequentemente estimula o córtex adrenal a libertar glucocorticoides para o sistema circulatório, proporcionando assim uma resposta adequado ao estímulo. Genes como FKBP5 e CRHR1 influenciam diretamente o eixo HPA ao regular a atividade dos glucocorticoides e de CRH, respetivamente. Por outro lado, genes como BDNF, OXTR e NPY atuam sobre estruturas reguladoras deste eixo, tal como o hipotálamo e a amígdala. O sistema nervoso central assim como o sistema nervoso simpático são responsáveis pela libertação de epinefrina e norepinefrina, estando envolvidos na regulação dos processos emocionais. Os genes MAOA e COMT são genes responsáveis pela inativação destes neurotransmissores, e como tal estão bastante envolvidos no bom funcionamento do sistema nervoso central e do sistema nervoso simpático. Por outro lado, os sistemas dopaminérgico e serotonérgico modulam a atividade do eixo HPA ao projetar tanto para as estruturas que o constituem como para as que o regulam, estando estes sistemas bastante envolvidos no processamento emocional e no controlo do estado de humor. O gene SLC6A4 é um importante determinante da neurotransmissão da serotonina ao regular o seu término e recaptação, enquanto que o gene SLC6A3 é responsável pela recaptação da dopamina, regulando assim a sua neurotransmissão. Já o gene DRD4 apresenta elevada variabilidade e codifica para um recetor de dopamina com expressão em diversas áreas do cérebro, tendo sido implicado em diversos distúrbios psiquiátricos. O estudo da resiliência e dos mecanismos a ela associados é de enorme relevância, não só porque permitem retratar e compreender melhor a genética dos traços de personalidade e dos distúrbios psiquiátricos, mas também porque a identificação de genes candidatos poderá permitir o desenvolvimento de novos marcadores para exames médicos, e a identificação de fatores protetores poderá prevenir respostas inadaptadas ao stress e assim ajudar a promover a resiliência e a saúde mental. Assim, este projeto visa compreender a genética molecular da resiliência, identificando os genes e marcadores moleculares que a ela poderão estar associados, assim como outros fatores externos que poderão influenciar este traço. Para tal, selecionou-se os genes e polimorfismos com maior evidência de estarem associados à resiliência, assim como a distúrbios psiquiátricos, nomeadamente depressão e distúrbios de ansiedade, através de uma extensa revisão bibliográfica, e identificou-se o genótipo, para os marcadores moleculares e genes selecionados, da população em estudo, 261 indivíduos portugueses, cujos componentes psicossociais já tinham sido previamente avaliados, através da aplicação de um questionário que continha a escala de resiliência de Connor-Davidson, entre outras. Para a genotipagem foram utilizados diversos métodos de biologia molecular, nomeadamente Sequenom MassArray, uma tecnologia que permite a genotipagem por espetrometria de massa, e sequenciação por método de Sanger, nos casos em que a primeira genotipagem não foi clara. Foi também utilizado para um dos polimorfismos um TaqMan® 5- nuclease assay, uma tecnologia baseada na técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em que a região flanqueadora do polimorfismo é amplificada na presença de sondas de fluorescência específicas, assim como PCR seguido de eletroforese em gel de agarose, para analisar os variable number of tandem repeats (VNTRs). De seguida, a inferência estatística permitiu avaliar a associação entre o genótipo dos indivíduos e os valores de resiliência, tendo em consideração outros parâmetros que pudessem influenciar este traço. Analisámos com sucesso 39 polimorfismos, após termos submetido todos os resultados obtidos pela genotipagem a um controlo de qualidade. Os polimorfismos excluídos da análise foram, portanto os que apresentavam um desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg e/ou os os genótipos dos indivíduos HapMap não correspondiam ao esperado, e como tal não passaram no controlo de qualidade. Os polimorfismos que passaram no controlo de qualidade, mas que se apresentaram como monomórficos também foram excluídos da análise, visto não serem uteis para um estudo de associação. Não nos foi possível genotipar com confiança os indivíduos para os VNTRs do gene MAOA e SLC6A4, devido a um artefacto visível no que se depreende ser os indivíduos heterozigóticos, possivelmente causado pelo “reannealing” de fragmentos complementares com sequências diferentes. A análise estatística univariada revelou associações entre a existência de depressão e ansiedade e menor resiliência, enquanto que maiores níveis de educação, como estudos pós-graduados e cursos profissionais, indicavam uma maior resiliência. A análise univariada também demonstrou a ausência de associação entre a resiliência e a idade, tomar comprimidos para dormir, o género e a tensão arterial. As outras escalas aplicadas na componente psicossocial eram responsáveis por avaliar o suporte social, a felicidade subjetiva, o estado de saúde mental e a presença de sintomatologia física e psicológica associada a stress. A análise revelou que maiores níveis de felicidade subjetiva, de estado de saúde mental e a ausência de sintomatologia associada a stress sugeriam maior resiliência. Porém, verificou-se que menor suporte social estava correlacionado com maior resiliência, o que vai contra o esperado e poderá ser devido ao tamanho da amostra. De todos os genes avaliados neste estudo, a análise univariada detetou apenas uma associação entre a resiliência e um polimorfismo do gene MAOA. Porém a análise haplotípica envolvendo este polimorfismo não revelou qualquer associação, o que aponta para um falso positivo. Ao realizar uma análise multivariada, ficou evidente que emoções e humores positivos assim como a ausência de sintomatologia psicológica relacionada a stress moderam a resiliência, demonstrando como um pensamento positivo permite construir melhores mecanismos de defesa contra situações adversas, assim como é elucidativo da importância de uma resposta biológica ao stress adequada e flexível, de modo a manter um funcionamento físico e psicológico normal em contexto de adversidade. A análise multivariada também revelou uma associação entre o polimorfismo rs53576 (G>A) pertencente ao gene OXTR, demonstrando que indivíduos que possuíam duas cópias do alelo considerado de risco (A) têm menor resiliência, deste modo indicando a influência deste gene no mecanismo biológico de resposta ao stress e na variabilidade deste traço. Por último, identificou-se também uma associação entre o alelo de risco (9 repetições) do VNTR do gene SLC6A3 e menor resiliência, o que vai de encontro a estudos anteriores que indicam que este alelo leva a uma menor atividade da proteína, afetando deste modo o mecanismo de resposta ao stress, e podendo assim causar variabilidade na capacidade de ultrapassar adversidades. É de denotar que na análise genotipíca, apenas obtivemos associação com o genótipo heterozigótico, e não para o genótipo homozigótico para o alelo de risco, e que apenas a análise alélica é que nos permite confirmar a associação entre o alelo de risco e o fenótipo de resiliência. Isto terá ocorrido devido à falta de representação deste genótipo na população em estudo. Este estudo apresenta algumas limitações, nomeadamente o tamanho da amostra, que se revelou pouco representativa em alguns casos. Deverá ter-se em conta que o pretendido era analisar o impacto de cada um dos marcadores em separado, e não obter um único modelo preditivo que explicasse os valores de resiliência, e assim não sentimos necessidade de corrigir os resultados aqui apresentados para testes múltiplos, que devem ser vistos como exploratórios. É de denotar também que a resiliência é um traço extremamente complexo e que não foi possível avaliar todos os genes envolvidos nos sistemas neurológicos e neuroquímicos nem todos os fatores ambientais que poderão influenciar a resiliência, e como tal os resultados descritos aqui poderão não se revelar verdade em estudos de maiores dimensões. Em conclusão e resumidamente, o presente trabalho fornece fortes evidências da influência da composição genética, bem como outras características pessoais, na resiliência.N/