Physical and functional interactions of the tumor suppressor protein p53 with poly(ADP-ribose) polymerase-1 and its enzymatic product poly(ADP-ribose)

Poly(ADP-ribosyl)ierung (PARylierung) ist eine wesentliche post-translationale Modifikation in Eukaryoten, die überwiegend von Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP1) ausgeführt wird. Sie spielt vor allem eine Rolle in der Signalkaskade von DNA Schäden, im Chromatin-Remodeling und in der Transkription. Proteine können kovalent PARyliert werden oder können nicht-kovalent mit poly(ADP-ribose) (PAR) interagieren. Das Tumorsuppressor protein p53 ist ein Substrat für kovalente PARylierung durch PARP1 und bindet auch nicht-kovalent PAR. Allerdings ist es unklar wie PARP1 p53 als Substrat für kovalente PARylierung erkennt und außerdem wie kovalente PARylierung und nicht-kovalente PAR Bindung in der Regulation von p53 zusammenwirken. In dieser Arbeit wurde p53 systematisch nach Regionen untersucht, die essenziell für nicht-kovalente PAR Bindung und für kovalente PARylierung von p53 sind. Eine bisher unbekannte PAR Bindestelle (Region 363-382) wurde in der hochbasischen und intrinsisch ungeordneten C-terminalen Domäne (CTD) von p53 entdeckt. Es stellte sich heraus, dass diese Stelle für die hauptsächliche PAR Bindung von p53 verantwortlich ist. Eine p53 Mutante konnte generiert werden, die kein PAR mehr bindet, indem vier entscheidende, basische Aminosäure zu Alanin ausgetauscht wurden. Interessanterweise ist dieselbe PAR Bindestelle auch essenziell für die kovalente PARylierung von p53 durch PARP1. Mehrere kovalente PARP1-vermittelte PARylierungsstellen konnten in der N-terminalen Transaktivierungsdomäne (TAD) von p53 identifiziert werden, wie E2, D7, E17 und E28. Wenn die TAD allerdings entfernt wird, kommt es immer noch zur kovalenten PARylierung. Nur wenn die nicht-kovalente PAR Bindung aufgehoben wird, wie durch das Entfernen der CTD, wird p53 auch defizient für kovalente PARylierung. Die p53 Mutante mit vier Aminosäuren-Substituierungen, die kein PAR mehr binden konnte, war ebenfalls defizient für kovalente PARylierung. Außerdem zeigte Auto-PARylierte PARP1 eine viel intensivere Interaktion zu p53, als unmodifizierte PARP1. Daher legen diese Ergebnisse nahe, dass nicht-kovalente PAR Bindung direkt die p53-PARP1 Interaktion vermitteln kann, sowie die Substraterkennung von p53 für kovalente PARylierung durch PARP1. Indem die CTD an ein Protein fusioniert wird, das normalerweise nicht PARyliert wird, wird dieses Protein ein Ziel von PARylierung. Dies bestätigt, dass die CTD der kritische Faktor für die Substraterkennung durch PARP1 ist. Bioinformatische Analysen zeigten, dass CTD-ähnliche Regionen im PARylierten Proteom stark angereichert sind. Dies legt nahe, dass ähnliche Mechanismen potentiell auch für die PARylierung von anderen Zielproteinen existieren. Zudem zeigten funktionelle Endpunktanalysen, dass nicht-kovalente p53-PAR Interaktion überwiegend die Sequenz-unabhängige, CTD-vermittelte DNA Bindung inhibiert. Andererseits wird die sequenz-spezifische DNA Bindung, vermittelt durch die zentrale DNA Bindungsdomäne (DBD) von p53, nur sehr gering durch PAR Bindung beeinflusst. Zelluläre Experimente haben gezeigt, dass PARylierung die transkriptionelle Aktivität von p53 beeinflusst, sowie die p53-Protein Interaktion und auch die p53-vermittelte Replikations-assoziierte Rekombination. Die Schlussfolgerung dieser Arbeit ist, dass nicht-kovalente PAR Bindung und kovalente PARylierung von p53 unzertrennlich miteinander verbunden sind und dass die CTD von p53 das Zentrum der Regulation von p53 durch PARylierung darstellt. Dieses Werk gibt eine mechanistische Erklärung wie p53 und potentiell andere Proteine zum Ziel von PARP1-vermittelter PARylierung werden.publishe