Dysfunktion und Regulation

Die Kernpore ist ein dynamischer makromolekularer Komplex, dessen strukturelle und funktionelle Eigenschaften je nach physiologischem Zustand der Zelle reguliert werden. In Anbetracht der Tatsache, dass der Austausch apoptotischer Signal- und Effektormoleküle zwischen Kern und Zytoplasma essentiell für deren Funktion ist, könnte die Regulation dieses Austausches ein Schlüsselelement apoptotischer Signalwege darstellen.Ziel dieser Arbeit war es, zum Verständnis der Regulation struktureller und funktioneller Veränderungen der Kern-Zytoplasma-Barriere beizutragen. Hierzu wurden drei unabhängige experimentelle Ansätze verfolgt.Im ersten Ansatz wurde ein in vitro Kernpermeabilitätsassay (NPA) verwendet, um den Einfluss einzelner molekularer Faktoren auf die Kernpermeabilität zu untersuchen. Hierzu wurde der NPA optimiert und validiert um statistisch aussagekräftige Probengrößen untersuchen zu können.Inhibitorstudien mittels NPA zeigten, dass ein durch den Serinproteaseinhibitor Pefablock inhibierbares Enzym die Kernpermeabilität beeinflusst.Als potentiell an der Regulation der Kernpermeabilität beteiligte Serinproteasen wurden sowohl Chymotrypsin-ähnliche Proteasen als auch die mitochondriale Serinprotease HtrA2/OMI näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Chymotrypsin-ähnliche Serinproteasen in dem untersuchten apoptotischen System in geringen, aber messbaren Mengen aktiviert werden. Die Aktivität der mitochondrialen Serinprotease HtrA2/OMI konnte nicht durch Pefablock gehemmt werden. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass HtrA2/OMI einen Einfluss auf die Kernpermeabilität und die proteolytische Prozessierung von Kernporenproteinen hat. Diese Ergebnisse legen nahe, dass, abhängig vom zellulären sowie apoptotischen Modelsystem, unterschiedliche Faktoren einen Einfluss auf die Kernpermeabilität haben.Im zweiten Ansatz wurde der Einfluss des membranständigen, anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 auf die Kernpermeabilität untersucht. Es wurde in zwei verschiedenen, stabil mit murinem oder humanem Bcl-2 transfizierten Zellinien, sowie nach transienter Transfektion gezeigt, dass Überexpression von Bcl-2 eine basale Erhöhung der Kernpermeabilität zur Folge hat. Dieses Ergebnis wurde mit drei verschiedenen experimentellen Ansätzen verifiziert: NPA, Bead Loading von fluoreszentem 70 kDa Dextran sowie Transfektion des Permeabilitätsmarkers 4xCherry.Es wurde gezeigt, dass ausschließlich an den Mitochondrien lokalisiertes Bcl-2 keinen Einfluss auf die Kernpermeabilität hat, wohingegen sich die Lokalisation and der ER und/oder Kernmembran als essentiell für die Bcl-2-bedingte Erhöhung der Kernpermeabilität erwies.Durch Überexpression der Calcium ATPase SERCA in Bcl-2 überexprimierenden Zellen konnte die erhöhte Kernpermeabilität wieder erniedrigt werden. Dieses Ergebnis legt nahe, dass Bcl-2 durch Calcium als Signalmolekül eine Erhöhung der Kernpermeabilität vermitteln könnte.Der dritte Ansatz der vorliegenden Arbeit bestand aus der Entwicklung eines Systems zur Visualisierung und Charakterisierung funktioneller sowie struktureller Veränderungen der Kernpore während der Apoptose mittels konfokaler Lebendzellmikroskopie. Es wurde gezeigt, dass transient mit fluoreszent markierten Kernporenproteinen transfizierte HeLa Zellen ein hierfür geeignetes zelluläres System darstellen. Nup153-GFP, wurde als geeignetes Markerprotein zur Visualisierung der Caspase-abhängigen Proteolyse von Kernporenproteinen identifiziert und validiert. Es konnte gezeigt werden, dass Spaltung an der Caspase-3-Schnittstelle notwendig für den Apoptose-bedingten Verlust von Nup153-GFP von der Kernpore ist. Im Gegensatz dazu, hat eine putative Caspase-8 Schnittstelle keinen Einfluss auf die Verankerung von Nup153-GFP in der Kernpore. Um Apoptose-induzierte Veränderungen der Kernpermeabilität zu visualisieren, wurde ein tetrameres fluoreszentes Markerprotein (4xCherry) hergestellt und als Permeabilitätsmarker validiert.Mit Nup153-GFP und 4xCherry als fluoreszente Markerproteine wurde eine auf konfokaler Lebendzellmikroskopie basierende Methode entwickelt, welche die spezifischen Anforderungen zur Visualisierung von Veränderungen der Kern-Zytoplasma-Barriere während der Apoptose erfüllt. Zur graphischen Auswertung der Ergebnisse wurde eine entsprechende Bildanalyseprozedur entwickelt.Mit Hilfe der entwickelten experimentellen Methode konnte gezeigt werden, dass die Kernpermeabilität sich, je nach apoptotischem Modelsystem, zu verschiedenen Zeitpunkten ändert. In zwei untersuchten Modellsystemen erfolgt die caspase-abhängige Spaltung von Kernporenproteinen zu einem späten Zeitpunkt, zeitgleich mit Veränderungen der Chromatinstruktur