Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von HIV-1 Hüllproteinen

Die Bindung und die Fusion eines HIV-Partikels an und in die Zielzelle ist ein essentielles Ereignis im Replikationszyklus von HIV. Dieser Vorgang der Fusion in die Wirtszelle, benötigt initial die Interaktion des HIV Hüllproteins (Env) mit dem CD4-Rezeptor und einem Chemokinrezeptor. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin eine strukturelle und funktionale Charakterisierung des vollständigen Hüllproteins von HIV aus einem CCR5-defizienten Patienten durchzuführen. In den vorangegangenen Arbeiten war in den HIV-Isolaten aus dem Patienten jeweils nur der V3-Loop des Hüllproteins sequenziert worden. Insbesondere sollte daher untersucht werden, ob Domänen im Hüllprotein außerhalb des V3-Loops einen Einfluss auf den Korezeptorgebrauch haben. Dazu wurde eine full-length-envelope PCR etabliert, welche in der Lage ist, verschiedene HIV-Isolate über eine Länge von 3000 Nukleotiden zu amplifizieren. Es wurde der Expressionsvektor pcDNA3.1 zur Klonierung des full-length-envelope in NEB5alpha kompetente Zellen ausgewählt, und die rekombinanten Plasmide in NEB5alpha kompetenten Zellen vermehrt. Zur Identifikation funktionaler Env-Klone wurde eine Sequenzierungsstrategie entwickelt. Es folgte eine Auswertung der klonalen Sequenzen auf Nukeotid- und Aminosäureebene von zwei Verlaufsisolaten des CCR5Δ32/Δ32 Patienten im Vergleich zu Referenzviren für CXCR4- und CCR5-Korezeptor. Funktionsale Expressionsplasmide wurden anschließend in 293T-Zellen transfiziert. In einem vorläufigen Zell/Zellfusionsassay wurden Env+-293T-Zellen mit CEM-Zellen kokultiviert, um die Funktionalität des exprimierten gp160 zu untersuchen. Mit der etablierten full-length-envelope PCR konnte erfolgreich das 3000 Bp Große Produkt amplifiziert werden. Die Klonierung in den Expressionsvektor pcDNA3.1 verlief ebenfalls erfolgreich. Mit Ausnahme des R5-Referenzvirus wurden von allen Virusisolaten mindestens drei funktionale Klone erhalten. Die anschließende Sequenzauswertung zeigte Unterschiede in Glykosylierungsmustern und der AS-Zusammensetzung von X4 und R5 Referenzviren zu den Isolaten des CCR5Δ32/Δ32 Patienten. Das Erstisolat zeigte im Vergleich zum Folgeisolat nur wenige AS-Substitution, und eine Deletion. Es konnte der Verlust einer putativen Glykosylierungsstelle gezeigt werden, sowie ein AS-Austausch auf den für den Korezeptorgebrauch wichtigen V3-Loop. Die Env+ 293T-Zellen, welche mit CD4+-CEM Zellen kokultiviert wurden, zeigten Syncytienbildung. Der vorläufige Fusionsassay zeigte die prinzipielle Funktionalität der HIV-1 Hüllglykoproteine auf der Zelloberfläche. Zur weiteren Charakterisierung der Evolution des Korezeptorgebrauches im CCR5Δ32/Δ32 Patienten ist es erforderlich einen quantitaiven Fusionsassay zu etablieren, mit dem sowohl die Rolle des AS-Austausches im V3-Loop als auch die Mutation der Glykosylierungsstelle im V4-Loop weiter untersucht werden können.The entry of HIV-1 into a host cell is mediated by the interaction of the viral envelope with the CD4-receptor and a co-receptor, mainly the chemokine receptors CCR5 or CXCR4. HIV co-receptor use is mainly determined by the V3 loop of the viral envelope protein. Mutations in the CCR5 receptor are known to have a strong influence on the course of the HIV infection. A functional 32bp deletion in the CCR5 gene correlates with a slow progression of the disease in heterozygous carriers and, if the gene is homozygous mutated, individuals are almost not susceptible to HIV. Nevertheless, a few HIV-infected people with a homozygous CCR5Δ32 genotype were described and one of them was identified in the German HIV-1 seroconverter cohort of the Robert Koch-Institute. In previous studies it was shown that the virus of this patient isolated early in infection could use the CCR5 and the CXCR4 co-receptor. During the course of infection the virus lost the CCR5 use and increased the CXCR4 co-receptor use. The aim of this study was to analyze the sequential virus isolates from the homozygous CCR5Δ32 patient in more detail by full length envelope sequencing and characterization. Therefore, a full length envelope PCR was established and the resulting 3000 bp envelope fragment cloned into the expression vector pcDNA3.1. Furthermore, a sequencing strategy was designed for structural characterization and a cell-cell-fusion assay was performed to determine the functional expression of gp120/gp41 in transfected 293T-cells by co-culture with CD4+ CEM-cells. The sequence analysis showed several differences between the first and the follow up isolate of the CCR5Δ32/Δ32 patient. We detected numerous amino acid substitutions, especially one in the hyper variable region 3, as well as the loss of a putative glycosylation motif within the hyper variable loop region 4. Comparisons of the reference sequences with the isolates from the CCR5Δ32/Δ32 patient revealed several insertion and deletions within the entire gp160. Subsequent experiment should comprise a quantifiable cellfusion assay to clearify the role of the missing glycosylation motif and the substituted amino acids. Viral escape by CXCR4 use during antiretroviral treatment of patients with CCR5 antagonist might be caused by alternative amino acid changes and therefore contribute to treatment failure