애기장대 세포분열조절에 필요한 NDC80 동원체 복합체의 SPC24 상동유전자 MUN의 기능 연구

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 자연과학대학 생명과학부, 2018. 2. 이일하.염색체의 중심절 (centromere)에 위치하는 동원체 (kinetochore)는 세포분열동안 방추사와 염색체의 접합을 유도하여 염색체 분리 과정을 매개하는 단백질 복합체이다. NDC80, NUF2, SPC24, SPC25 4개의 단백질로 구성된 NDC80 복합체는 외부 동원체에 위치하여 방추사와 동원체를 이어준다. 다양한 생물종들에서 보존되어 있음에도 불구하고, NDC80 복합체의 단백질들은 기능상실돌연변이체의 심한 표현형 때문에 현재까지 제한적인 연구만 진행되었다. 특히 모델식물인 애기장대에서 SPC24 상동유전자는 전혀 보고되지 않았다. 본 연구를 통해 애기장대의 열성 돌연변이체인 meristem unstructured-1 (mun-1) 에 대한 특성 분석을 개체 수준에서 진행하였다. mun-1은 WUSCHEL 유전자를 비롯한 분열조직 관련 유전자들의 전위적 과발현으로 인해 정단분열조직이 비구조화되어 비정상적인 형태 발생을 보인다. mun-1은 NCD80복합체의 SPC24 상동유전자 프로모터 부위에 T-DNA가 삽입되어 MUN유전자의 발현이 감소한, 표현형의 발현에 있어서 불완전침투성 (incomplete penetrance)을 보이는 약대립유전자 (weak allele) 돌연변이체이다. mun-1은 성장저해, 배발생 정지, DNA 이수성 (aneuploidy), 염색체 분리 이상, 낮은 세포분열 속도 등의 표현형을 보인다. TALEN과 CRISPR/Cas9 기반의 유전자 가위 기술을 적용하여 생성된 MUN의 비대립 유전자 (mull allele mutants) 돌연변이체들은 다른 NDC80복합체의 돌연변이체인 nuf2-1와 같은 배아 치사성 (zygotic embryonic lethality)을 보인다. 해당 비대립 유전자들은 화분, 밑씨를 통해서 다음세대로 성공적으로 전달된다. 효모단백질잡종법과 식물체 내 공면역침강법을 이용하여 애기장대 NDC80 복합체 단백질들간의 결합을 확인하였다. MUN은 식물체 전반에 걸쳐 주로 활발하게 분열하는 세포조직에서 발현되며 히스톤 변형체로 중심절 표지 인자인 HTR12/CENH3 단백질과 세포내 동일위치에 존재함이 규명되었다. MUN이 HTR12/CENH3의 세포내 위치에 영향을 미치지 않는 것으로 보아 MUN은 외부 동원체 단백질로서 내부 동원체 단백질들의 조립 이후 동원체에 결합 하는 것으로 추정된다. 본 연구를 통해 애기장대의 SPC24 상동유전자인 MUN의 존재와 세포분열조절기능을 규명하였다. 동물 NDC80 복합체와 달리, 애기장대의 NDC80복합체들은 세포 분열 주기 전 과정에서 동원체에 위치하고 있음을 확인하였다. 추가적으로 MUN과 세포분열조절인자 RBR간의 결합을 확인하였다. 따라서 애기장대의 MUN은 동원체의 구조적인 요소일 뿐 아니라 세포분열 조절인자로서의 기능도 가진 복합기능 단백질로 추정된다. 한편, 약대립유전자(weak allele) 돌연변이체 mun-1의 표현형 분석을 통해 동원체 단백질의 기능결손이 줄기세포의 이상 생성과 관련이 있다는 사실을 알 수 있었다. 본 연구를 통해 동물과 차별화되는 식물의 세포분열 및 동원체 단백질 조절 기작의 일부를 규명하였다. 주요어: SPC24, NDC80 복합체, 동원체, 중심절, 염색체 분리, 세포 분열, 애기장대 학 번: 2008-20360Kinetochore, a protein super-complex on the centromere of chromosomes, mediates chromosome segregation during cell division by providing attachment sites for spindle microtubules. The NDC80 complex, composed of four proteins, NDC80, NUF2, SPC24, and SPC25, is localized at the outer kinetochore and connects spindle fibers to the kinetochore. Until date, loss-of-function analyses of the components have been limited because of the severe defects in the growth and development of the mutants, although the complex is conserved across species. In addition, SPC24 homolog in plants has not been disclosed yet, the functional studies are rare in Arabidopsis thaliana. Here, I characterize a recessive mutant, meristem unstructured-1 (mun-1), at organismal level in Arabidopsis thaliana. The mutant mun-1 exhibits an abnormal phenotype with unstructured shoot apical meristem caused by ectopic expression of the WUSCHEL and meristem identity genes in unexpected tissues. The mutant mun-1 is a weak allele and shows incomplete penetrance because of the insertion of T-DNA in the promoter region of the SPC24 homolog, which is a component of NDC80 complex. The mun-1 mutant exhibits stunted growth, embryo arrest, DNA aneuploidy, and defects in chromosome segregation, with a low cell division rate. Null mutants of MUN from transcription activator-like effector nuclease (TALEN) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9)-mediated mutagenesis showed zygotic embryonic lethality similar to that in nuf2-1, which is another mutant of NDC80 complex. However, the null mutations were fully transmissible via pollen and ovules. Interactions among the components of the NDC80 complex were confirmed in a yeast two-hybrid assay and in planta co-immunoprecipitation. MUN is expressed in actively dividing tissues in whole plants and co-localized at the centromere with HTR12/CENH3, which is a centromere-specific histone variant. However, MUN is not required to recruit HTR12/CENH3 to the kinetochore, indicating that MUN is assembled into kinetochore after the loading of inner kinetochore components, as typical of the outer kinetochore components. My results support that MUN is a functional homolog of SPC24 in Arabidopsis thaliana, which is required for cell division. In contrast to animals, NDC80 complex in Arabidopsis thaliana localizes constitutively to the kinetochore throughout the cell cycles. In addition, I report the novel interaction between MUN and RBR, the well-known cell cycle regulator. Thus, I suggest the MUN is a dual-function protein, which is not only a structural component of kinetochore, but also a regulator of cell cycle in plants. In addition, I report the novel case of ectopic generations of stem cell niches by the malfunction of kinetochore components. This study provides cornerstones of studying the differences between plant and animal kinetochores related cell division.I. Background 1 1.1. Cell cycle 1 1.2. Kinetochore 2 II. Introduction 5 III. Materials and methods 8 3.1. Plant materials and growth conditions 8 3.2. Constructs design 8 3.3. Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction and molecular marker-assisted mapping 9 3.4. Gene expression analysis 9 3.5. Confocal laser scanning microscopic analysis 10 3.6. Imaging scanning electron microscopy 11 3.7. Targeted gene knockout by TALEN and CRISPR/Cas9 11 3.8. Flow cytometry analysis 12 3.9. Edu cell proliferation assay 13 3.10. Seed-set analysis, whole-mount clearing, and pollen viability analysis 13 3.11. GUS staining 14 3.12. Multiple alignment and phylogenetic analyses 14 3.13. Yeast two-hybrid assay 15 3.14. Co-immunoprecipitation (Co-IP) assays 15 3.15. Measurement of hormones by liquid chromatography/time-of-flight/mass spectrometry (LC/TOF-MS) Analysis 16 3.16. Accession Numbers 17 IV. Results 19 4.1. A weak allele, mun-1, shows unstructured SAM, growth retardation, defects in embryo development, and spontaneous de novo shoot organogenesis 19 4.2. Spontaneous de novo shoot organogenesis (DNSO) in mun-1 occurs without hormone treatment 31 4.3. Abnormal regulations of hormones in mun-1 35 4.4. Defects in cell division and chromosome segregation, and aneuploidy, in mun-1 plants 38 4.5. MUN encodes a SPC24 homolog, a member of the NDC80 kinetochore complex 45 4.6. MUN is predominantly expressed in actively dividing tissues and the protein is co-localized at the centromere with HTR12/CENH3 54 4.7. MUN interacts with components of the NDC80 complex 61 4.8. Null mutation in MUN causes zygotic embryonic lethal phenotype 69 4.9. K/O alleles of MUN and NUF2 shows same zygotic embryo lethal phenotype 70 4.10. mun-2T and nuf2-1 did not show the phenotypes in gamete development 70 4.11. MUN might have a role in cell cycle regulation with RBR 78 V. Discussion 83 5.1. MUN is an ortholog of SPC24, a component of the NDC80 kinetochore complex 83 5.2. Divergence of the plant NDC80 complex 85 5.3. Null mutations of the NDC80 complex are fully transmissible via pollen and ovules: Concentration or Meitosis theory 87 5.4. Spontaneous de novo shoot organogenesis in mun-1 88 5.5. MUN might have dual functions as a cell cycle regulator. 90 VI. References 93 VII. Abstract in Korean 국문초록 103 VIII. Appendix 종자분주기 등록특허공보 및 특허증 105Docto