재조합 발현을 이용한 개 cytochrome P450 1A1 변이형의 생화학적 분석

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 수의학과 수의병인생물학 및 예방수의학(환경위생학) 전공, 2016. 2. 류덕영.Cytochrome P450 (CYP)는 heme-thiolate 효소로서 대부분의 생물 종에서 발견되며, 포유동물에서 약물, 생체 내 물질(endogenous substances), 그리고 생체 외 물질(xenobiotics)의 최초대사와 관련 되어있다. CYP는 주로 세포 내 소포체(endoplasmic reticulum)에 존재한다. CYP1A1은 간 외 조직, 주로 폐 조직에서 매우 높게 발현되며, 환경 발암물질(environmental carcinogen)과 환경 호르몬의 대사에 매우 중요한 역할을 담당하고 있다. 인간 CYP1A1 유전자는 다형성을 나타내며, 소수의 단일 염기서열다형성이 보고 및 연구 되었다. 하지만 개 CYP1A1 유전자의 다형성에 대한 연구는 아직 보고된 바 없다. 본 연구에서는 삽살개의 cDNA 서열을 분석하여 2종류의 CYP1A1 변이형을 발견하였고, 이를 각각 Sap1과 Sap2라고 명명하였다. 2종류의 CYP1A1 변이형은 50번째 아미노산 서열에서 차이를 보였다. Sap1은 50번째 아미노산에 Trp이 위치하였고, Sap2는 Leu이 위치하였다. 2종류의 CYP1A1 변이형은 대장균 세포 내에서의 CYP1A1 아포효소(apoenzyme)의 전사, 번역 효율에 영향을 주지 않았으며, 대장균 세포막에 CYP1A1 단백질이 결합되는 정도에도 영향을 주지 않았다. 그러나 Sap1의 CYP 완전효소(holoenzyme)의 양은 Sap2에 비해 낮은 것으로 나타났는데, 이것은 Sap1 변이형 단백질이 heme기가 결여된 무기능 단백질 형태로 존재한다는 것을 시사한다. 하지만, 제 기능이 유지된 완전효소 양을 기준으로 하여 Sap1과 Sap2 단백질의 7-에톡시레소루핀-O-디에틸라아제(EROD) 활성을 비교할 경우, Sap2의 활성이 Sap1의 활성에 비해 낮았다. 이 결과를 토대로, 50번째 아미노산의 변이는 단백질 구조를 변화시키고 heme기의 결합에 영향을 미친다는 것이 예상 되었다. Site-directed mutagenesis 기술은 CYP1A1의 구조와 기능의 상관관계를 규명하고 중요한 아미노산 서열을 알아내는데 매우 유용하게 사용되었다. CYP1A1의 구조 내 상호작용의 특징을 설명하기 위해 50번째 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여 동일한 실험을 수행하였다. 그 결과 50번째 아미노산 위치에 잔기의 분자량이 40-60 정도 되는 소수성 아미노산인 Val, Leu, Ile이 위치하는 경우 CYP 단백질의 heme기 결합 능력이 증가하는 양상을 보였다. 반면 7-에톡시레소루핀-O-디에틸라아제 활성은 감소하는 양상을 보였다. 이러한 결과는 50번째 아미노산의 변이가 CYP 단백질의 heme기의 유입(heme incorporation)과 효소 활성에 영향을 줌으로써, 기능 변화를 유발한다는 것을 시사한다.Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) is a heme-containing enzyme involved in metabolism of xenobiotics. Although a number of human CYP1A1 have been studied extensively, there are limited studies reported on the characterization of the CYP1A1 in dog. In this study, we isolated, sequenced CYP1A1 cDNA in Sapsaree breed and two kinds of CYP1A1 cDNA sequences, Sap1 and Sap2, were found. Single nucleotide change was found between two sequences, which have Trp in the Sap1 variant and Leu in the Sap2 variant at position 50. The canine CYP1A1 variants were expressed in Escherichia coli and human CYP1A1 was used as control. CYP contents (i.e. holoenzyme) and heme contents were higher in the Sap2 variant compared to the contents of the Sap1 variant. However 7-ethoxyresorufin O-dealkylation (EROD) activities were reduced in E.coli membranes expressing the Sap2 variant. To clarify the impact on the holoenzyme formation and catalytic activity, substitution of codon 50 was conducted. The substitution of codon 50 by isoleucine exhibited a similar CYP content with the Sap2 variant, whereas substitution of other hydrophobic amino acid residues did not increase the level of CYP produced. However, EROD activities revealed that the substitution of codon 50 with hydrophobic amino acid residues such as Val, Ile, and Leu showed lower catalytic activities than those of other hydrophobic amino acid residues. The substitution to residues having polar or charged amino acid such as Lys, Asp and Asn also did not increase in CYP content and catalytic activities of the recombinant enzymes. These findings suggest that the position of codon 50 within canine CYP1A1 affects heme incorporation and enzyme activities.Introduction 1 Materials and Methods 5 Chemicals 5 Preparation of lymphocytes 5 cDNA cloning and sequencing 5 Bacterial constructs 6 Bacterial expression 7 CYP and heme contents 8 Immunoblots 8 Site-directed mutagenesis 9 7-Ethoxyresorufin O-dealkylation (EROD) 9 Sequence alignment 10 Statistics 10 Results 11 Sapsaree CYP1A1 cDNAs 11 Expression in E. coli 11 Enzyme activities of E. coli 13 Substitution of human CYP1A1 13 Substitution of codon 50 14 Catalytic activities of the E. coli membrane fractions expressing substitution of codon 50 15 Discussion 16 References 20 Figures 27 Table 45 국문 초록 48Maste