GC/MS를 이용한 폐암세포 A549의 starvation에 따른 대사체 변화 분석

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 약학과, 2014. 2. 박정일.암세포는 생체 내에서 성장 및 생존 하는 데에 있어서 정상 세포에 비하여 많은 영양분을 요구하게 된다. 그럼에 따라 주변의 영양소가 급격히 소모되고, 이를 보충하기 위해 미세혈관의 확장작용이 일어나게 된다. 이때, 영양소의 급격한 소모에 따른 암세포의 생리적인 형질의 변화가 일어날 것이라 예상되며, 따라서 영양분이 부족한 상황에서 암세포의 생리를 연구하는 것은 암의 병리를 이해하는 데에 있어서 매우중요하다고 할 수 있을 것이다. 본 연구에서는 A549 폐암세포주를 이용하여 invitro-starvation 시 변화하는 대사체를 연구하고자 하였다. A549를 배양시 영양분의 양을 다르게 하면 세포 내에 대사과정에서 변화가 있을 것이라 예상 되었고 이에 따라 대사체들에 변화가 있을 것으로 예상되었다. 우리는 A549세포에 대해 FBS를 10 %, 2 % 그리고 0 %로 조절하여 배양 후 이들의 대사체를 분석함으로써 A549 세포가 starvation이 되었을 때 발생하는 대사체의 변화를 관찰하였다. 대사체 변화분석은 GC/MS, LC/MS 와 NMR등 의 기기를 이용해서 연구되고 있다. 그 중 본 연구에서 사용한 GC/MS는 기존에 설립된 풍부한 대사체 library를 매우 쉽게 이용할 수 있기 때문에 대사체 분석에 있어서 매우 용이하였다. 3가지의 cell 개수를 동일하게 모아서 Chloroform : Methanol : Water (2 : 5 : 2)로 추출하였고, methoxyamine과 BSTFA (1 % TMCS)를 이용하여 유도체화 하였다. GC column 은 DB-5 (30 m X 0.25 mm, 0.25 ㎛)를 사용하였으며, MS는 scan mode로 설정하여 전체적인 대사체의 차이를 확인할 수 있게 분석하였다. 세포내의 대사체들은 authentic standard를 사용하여 동정 하였고 그 결과 총 64종의 metabolite들을 동정 할 수 있었다. 3가지 그룹간의 차이를 살펴본 결과 3-Hydroxybutyric acid 와 malic acid는 FBS의 양이 감소할 때 같이 감소하는 경향을 보였다. 반면에, Pyroglutamic acid 및 glutamic acid, Hypoxanthine은 starvation 시킨 그룹에서 증가되어 있었다. 결론적으로 위 5가지 대사체들의 증감에 관여하는 biological pathway가 starvation상황에서 A549 폐암세포주의 생리활성에 영향을 미칠 것이라 예상되며, 이를 추가 연구를 위한 발전 가능성으로 삼을 수 있을 것이라 기대된다.Ⅰ. 서 론 1 Ⅱ. 실험 3 1. 시료 3 2. 시약 및 기기 3 2-1. 표준품, 시약 및 용매 3 2-2. 실험 기구 4 2-3. 분석기기 4 3. 실험방법 5 3-1. A549 세포배양 5 3-2. 시료 전처리 및 유도체화 6 3-3. GC/MS 분석조건 8 Ⅲ. 결과 9 1. 대사체들의 identification 9 2. 그룹간의 차이가 나는 대사체들 12 3. FBS starvation 시 A549세포의 대사과정 14 3-1 암세포의 대사과정 14 3-2 Starvation 조건에서 감소한 대사체 16 3-3 Starvation 조건에서 증한 대사체 18 Ⅳ. 결론 20 Ⅴ. 참고문헌 21Maste