Einfluss der Rezeptortyrosinkinase RET auf die Pathogenese der akuten myeloischen Leukämie

Die akute myeloische Leukämie ist trotz Fortschritten in der Therapie weiterhin eine Erkrankung mit geringer Heilungschance und hoher Rezidivrate nach Therapie. Bei der Suche nach zielgerichteten Therapien haben wir mittels RNA interference (RNAi) Screens die Rezeptortyrosinkinase (RTK) RET (Rearranged during Transfection) als potentielle Zielstruktur identifiziert. Gegenstand meiner Arbeit war es näher zu untersuchen, ob und inwiefern RET in der akuten myeloischen Leukämie (AML)- Pathogenese von Bedeutung ist, und aufgrund der geringen Heilungsrate auch nach eventuellen Therapiestrategien zu suchen. In meiner Arbeit befasste ich mich zunächst damit, ob Leukämiezellen RET exprimieren. Ich konnte zeigen, dass insbesondere myelomonozytär differenzierte AML-Zelllinien des FAB (French-American-British)- Subtyps M5 ein hohes RET9- und RET51-Expressionslevel besitzen. Dies stimmt auch mit der vorhandenen Literatur überein. Im Gegensatz hierzu fand ich in gesunden Mono- und Granulozyten nur RET9- und keine RET51-Expression. Dies legt eine mögliche spezifische Rolle von RET51 in der Pathogenese der AML nahe. Weitere Untersuchungen mit der Frage nach der funktionellen Bedeutung der beiden Isoformen sollten sich anschliessen. Um eine Signalkaskade zu starten, muss RET über einen Liganden aktiviert werden, und in der Folge kommt es zu einer Phosphorylierung verschiedener Tyrosinreste von RET. Diese Phosphorylierung und somit die Aktivität von RET wollte ich in AML-Zelllinien nachweisen. In MOLM-14, einer AML-Zelllinie, konnte ich eine allgemeine Phosphorylierung von RET zeigen und durch RPI-1, einen Inhibitor von RET, in der Folge eine Dephosphorylierung von RET erzielen. Übertragen konnte ich damit die Aktivität von RET in dieser Zelllinie beweisen. Bei dem Blick auf den spezifischen Tyrosinrest 905 waren wir mit der Detektion nicht erfolgreich. Hier würde sich der Tyrosinrest 1062 als nächster Punkt empfehlen. Nach der Aktivität von RET war es weiter wichtig zu untersuchen, ob AML-Zellen von der RET-Expression abhängig sind. Ich konnte mittels RNAi beweisen, dass alle Zellen mit positivem RET durch die Suppression von RET nicht mehr weiter wachsen, was eine Abhängigkeit der Zellen von RET erkennen lässt. Auch mit RPI-1 liess sich die Abhängigkeit bestätigen. Am empfindlichsten reagierten die Zelllinien mit weiteren RTK-Mutationen, weniger empfindlich diejenigen mit einer RAS (Rat sarcoma virus oncogen)- Mutation. Somit scheinen auch die weiteren Mutationen einer Zelllinie eine Rolle im Bezug auf das Wachstum von AML-Zelllinien zu spielen. Wichtig wäre nun zu wissen, ob die Zellen durch die Suppression von RET in Apoptose gehen oder ob eine verminderte Proliferation der Zellen resultiert. Wie sich die Signalwege von RET verhalten, war ebenfalls Gegenstand meiner Untersuchungen. Bei den Experimenten zum Signaling von RET konnten wir zwei Wege herausarbeiten, die eine übergeordnete Rolle zu spielen scheinen. In allen von uns untersuchten Zelllinien wurde durch die Blockierung von RET PKC (Protein kinase C) alpha hochreguliert. Die Hochregulierung von PKCalpha ist eventuell somit ein kompensatorischer Versuch der Zelle, sich aufrecht zu erhalten. Bei FLT3 (Fms-related tyrosine kinase 3)- mutierten Zelllinien, einer anderen Rezeptortyrosinkinase, führte die Blockierung von RET scheinbar zu einer Aktivitätsverminderung von STAT5 (Signal transducer and activator of transcription 5). Eine Ableitung hiervon kann sein, dass STAT5, wie bisher noch nicht bekannt, als direkter Effektor des Signalings von RET vorkommt, oder dass RET und FLT3 vielleicht auch direkt miteinander interagieren und STAT5 so beeinflussen. Für AKT (V-akt murine thymoma viral oncogene homolog), ERK (Elk-related tyrosine kinase) und STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) konnte aus unseren Daten keine zentrale Aussage abgeleitet werden. Den möglichen Cross-Talk von RET und FLT3 wollten wir noch weiter beleuchten. Unsere Experimente hierzu zeigten, dass durch die Kombination von RPI-1 und PKC412, einem FLT3-Inhibitor, eine additive bzw. synergistische Wirkung auf RET-positive, FLT3-mutierte Zelllinien erzielt werden konnte. Bei einem weiteren Versuch mit einer Kombination aus RET-knockdown (KD) und PKC412 konnten wir ebenfalls die beste Proliferationshemmung im Vergleich zu den einzelnen Behandlungen erzielen. Dies könnte spezifisch für Patienten mit einer FLT3-Mutation einen therapeutischen Vorteil bringen. Die Phosphorylierung von FLT3 konnte durch einen KD von RET nicht beeinflusst werden. Jedoch zeigte sich bei der spezifischen Phosphorylierungsstelle Tyr842, die im Aktivierungsloop von FLT3 liegt, eine verminderte Phosphorylierung. Dies erweckt ebenfalls den starken Verdacht, dass RET und FLT3 interagieren. Tyr591 war in meinen Untersuchungen nicht detektierbar. Weitere Phosphorylierungsstellen könnten Gegenstand weiterer Experimente sein