Análisis molecular, bioquímico y estructural de la ß-lactamasa de espectro extendido PER-2 : participación de aminoácidos específicos en la interacción con sustratos e inhibidores

PER-2 has been the second most prevalent acquired extended spectrum ß-lactamase in clinical isolates of enterobacteria in Argentina. Even if natural mutants of PER-2 have not yet been reported, constant selective pressure posed by the extensive antibiotic and inhibitors use, and the known evolutionary outcomes for other ?-lactamase families, we wondered about the actual possibility to evolve by point mutations that further improve or modify its catalytic efficiency and/or decrease susceptibility to inhibitors. By means of in silico modeling, we observed that Arg220 in PER-2 is located at equivalent spatial position than Arg244 in TEM-1/SHV-1. As inhibitor resistant TEM/SHV can arise by single mutations in this residue, we postulated that similar behavior can be obtained by mutations at Arg220 in PER-2. We also hypothesize that Thr237 can also play important role due to its structural association with Arg220. In this study, we analyzed the biochemical behavior of PER-2 derived in vitro mutants at positions 220 and 237, assigning their role in the hydrolysis and inhibition of the enzyme, we solved the crystallographic structure of PER-2, and we performed a preliminary characterization of a plasmid harboring blaPER-2.Fil: Ruggiero, Melina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, ArgentinaPER-2 fue históricamente la segunda ß-lactamasa de espectro extendido plasmídica más frecuente en aislamientos clínicos de enterobacterias en Argentina. Si bien no se han reportado variantes mutacionales de PER-2, debido a las constantes presiones selectivas ejercidas por el uso masivo de antibióticos e inhibidores, y a los antecedentes de evolución en otras enzimas, nos planteamos si la misma puede evolucionar y modificar sus aptitudes hidrolíticas y/o ser menos susceptible a la inhibición. Por modelados computacionales se pudo apreciar que Arg220 de PER-2 ocupa estructuralmente un espacio equivalente a Arg244 en TEM-1/SHV-1. Ya que en enzimas resistentes a inhibidores derivadas de TEM/SHV la sustitución en Arg244 es suficiente para conferir el fenotipo resistente, se postula que modificaciones en Arg220 de PER-2 podrían tener un efecto similar. También postulamos que Thr237, cercana a Arg220 según nuestros modelos, tendría un potencial papel en la estructura-función de PER-2. En el presente trabajo se realizó la caracterización bioquímica de variantes mutacionales en posiciones 220 y 237 obtenidas in vitro determinando la participación de estos residuos en la hidrólisis e inhibición, la resolución de la estructura cristalográfica de PER-2 y la caracterización preliminar de un plásmido portador del gen blaPER-2