Estudio de los determinantes moleculares involucrados en la traducción de los ARN mensajeros de arenavirus

The genome of Tacaribe virus (TCRV), prototype of the New World\narenaviruses, encodes four proteins which are expressed from subgenomic\nmessenger RNAs (mRNAs). These mRNAs contain Cap structure at the 5? end,\nand lack a 3? poly(A) tail, exhibiting a 3? untranslated region (UTR) predicted to\nform a stable secondary hairpin structure with a suspected role in translation.\nTo analyze the contribution of non-coding sequences to TCRV mRNAs\ntranslation, we generated a synthetic transcript mimicking the TCRV\nNucleoprotein (NP) mRNA, which contains the Firefly Luciferase (FLUC) open\nreading frame. Mutant mRNAs were designed to carry modifications in either\nthe 5? or the 3? UTR. Translation from these virus-like mRNAs in transfected\ncells was evidenced by FLUC activity, along with determination of mRNA\nstability by qPCR. Taken together, the data suggested that the predicted hairpin\nstability at the 3?UTR and/or its G/C content play a modulatory role in\ntranslation. In addition, both the sequence neighboring the stop codon in the 3?\nUTR, and the 5' UTR were found to contain sequence or structure elements\nwhich stimulate translation. It was also observed that the presence of NP or\nother viral proteins do not affect translation, and that this process requires the\neukaryotic translation factor eIF4GI. Also, this study succeeded in developing a\nreverse genetic system that directs the generation of recombinant TCRV, a\nvaluable tool that will allow performing mechanistic studies in the context of a\nviral infection.Fil: Foscaldi, Sabrina Andrea. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, ArgentinaLas proteínas del virus Tacaribe (TCRV), prototipo de los arenavirus del\nNuevo Mundo, se expresan a partir de ARN mensajeros subgenómicos\n(ARNm), los cuales contienen estructura Cap en su extremo 5?, carecen de cola\nde poli(A) en el extremo 3?, pero presentan una región 3? no codificante que\npuede potencialmente formar una estructura secundaria de horquilla (hairpin II),\ncon un presunto papel en la traducción. Para analizar la contribución de las\nsecuencias no codificantes en la traducción de los ARNm de TCRV, se generó\nun transcripto sintético que imita al ARNm de la Nucleoproteina viral (NP), y\nque contiene el gen de la Luciferasa de luciérnaga (FLUC). Además, se\ngeneraron transcriptos mutantes con modificaciones en la secuencia 3' o 5? no\ntraducible. La eficiencia de traducción de esos transcriptos en células\ntransfectadas fue evidenciada mediante la determinación de la actividad FLUC,\njunto con la determinación de su estabilidad mediante PCR cuantitativa. En\nconjunto, los datos sugieren que la estructura secundaria en la secuencia\nhairpin II y/o su contenido de residuos G/C juegan un papel modulador en la\ntraducción. Por otra parte, tanto la secuencia proximal al codón de terminación\nen la región 3? no traducible, como la región 5' no codificante contienen motivos\nde secuencia o estructura que estimulan la traducción. Se encontró que la\npresencia de NP u otras proteínas virales no afectan la eficiencia de traducción,\ny que este proceso requiere del factor de traducción eucariota eIF4GI. Además,\nen este trabajo se desarrolló un sistema de genética inversa que dirige la\ngeneración de TCRV recombinante, una herramienta valiosa que permitirá la\nrealización de estudios mecanísticos en el contexto de la infección viral